黃凱宗，李晶晶，李巍，葛慧華，王文研，張光亞

華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系，廈門(mén) 361021

類(lèi)彈性蛋白多肽的從頭設(shè)計(jì)、非色譜純化及鹽效應(yīng)

黃凱宗，李晶晶，李巍，葛慧華，王文研，張光亞

華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系，廈門(mén) 361021

旨在克隆、表達(dá)與純化類(lèi)彈性蛋白多肽，并測(cè)定類(lèi)彈性蛋白的相變溫度對(duì)不同的鹽敏感程度。從頭設(shè)計(jì)了類(lèi)彈性蛋白多肽的序列并人工合成其編碼基因片段，克隆至改造后的表達(dá)載體pET-22b(+) 中，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) 中并誘導(dǎo)表達(dá)，采用可逆相變循環(huán)經(jīng)高速離心對(duì)其進(jìn)行純化，并考察了鹽類(lèi)型及濃度對(duì)類(lèi)彈性蛋白相變溫度的影響。結(jié)果表明：0.4 mmol/L的Na2CO3能使25 μmol/L類(lèi)彈性蛋白多肽 [KV8F-20] 相變溫度降低至19 ℃，此類(lèi)彈性蛋白多肽序列有望開(kāi)發(fā)成一新型純化標(biāo)簽，為今后重組蛋白的非色譜分離純化奠定基礎(chǔ)。

類(lèi)彈性蛋白多肽，非色譜法純化，可逆相變循環(huán)，相變溫度，純化標(biāo)簽

Abstract:Elastin-like polypeptides (ELPs) are temperature sensitive biopolymers composed of a Val-Pro-Gly-Xaa-Gly pentapeptide repeat that derived from a structural motif found in mammalian elastin. It was a promising tag for recombinant protein purification. Here, we de novo designed a novel ELPs gene and cloned it into the modified expression vector pET-22b(+). Then, we transformed the recombinant expression vector pET-22b-ELPs into Escherichia coli BL21(DE3). Upon induction by Isopropyl β-D-Thiogalactoside (IPTG), ELPs was expressed and purified by a non-chromatographic purification method named inverse temperature cycling. The influences of salts types and concentrations on ELPs were also determined. The results showed that the transition temperature of the [KV8F-20] decreased to 19 °C by 0.4 mmol/L Na2CO3. Due to its small molecular weight and sensitivity to salt, the ELPs might be a useful purification tag, which can provide a reliable and simple non-chromatographic method for purification of the recombinant protein by inverse transition cycling.

Keywords:elastin-like polypeptides, non-chromatographic purification, inverse transition cycling, transition temperature,purification tag

蛋白質(zhì)分子大規(guī)模分離純化是當(dāng)前生物工程中的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，純化過(guò)程所需成本約占總成本的60%~70%，色譜法為目前分離蛋白較成熟的方法。融合標(biāo)簽技術(shù)極大地簡(jiǎn)化了重組蛋白質(zhì)的純化過(guò)程，它通過(guò)融合一段特定的多肽 (如組氨酸標(biāo)簽) 進(jìn)行融合表達(dá)，并通過(guò)適當(dāng)?shù)挠H和力或者對(duì)配體有高特異性，融合蛋白可以與固相基質(zhì)上的特異配基結(jié)合，從而使重組蛋白質(zhì)得以純化[1]。但在實(shí)際應(yīng)用中，親合色譜法成本很高，不僅需要特殊設(shè)備，須對(duì)固相基質(zhì)進(jìn)行定制，難以放大到工業(yè)規(guī)模，且純化效率低[2]。

類(lèi)彈性蛋白多肽 (Elastin-like polypeptides，ELPs) 是一種具有彈性功能且對(duì)環(huán)境溫度非常敏感的人造基因工程蛋白質(zhì)聚合物。其結(jié)構(gòu)主要由五肽重復(fù)序列單元構(gòu)成，即 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG)，源自于彈性蛋白的疏水區(qū)域，其中 Xaa可以是除 Pro以外任一氨基酸。ELPs有一個(gè)可逆相變過(guò)程，稱(chēng)之為反轉(zhuǎn)變溫度 (Inverse temperature transition，ITT)，若環(huán)境溫度低于該相變溫度(Transition temperature)，該多肽在水溶液中為高度可溶，聚合物鏈保持無(wú)序結(jié)構(gòu)，且相當(dāng)伸展。相反，當(dāng)溫度高于該溫度時(shí)，該含水的多肽鏈結(jié)構(gòu)就瓦解，并開(kāi)始聚集，形成一個(gè)富含 ELPs的聚集物，由于ELPs具有這種特殊性質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化與質(zhì)粒DNA分離[3-8]。本研究設(shè)計(jì)了一新型ELPs (即ELP[KV8F-20])，人工合成其基因，成功在宿主菌表達(dá)并純化，同時(shí)測(cè)定其對(duì)鹽的敏感程度，為下一步純化重組蛋白提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 ELPs的命名

ELP[XiYjZk-n] 代表整個(gè)ELPs序列中有n個(gè)五肽，五肽中第 4個(gè)氨基酸殘基組成比例為 X:Y:Z=i:j:k[2]。如ELP[KV8F-20]，是一個(gè)包含20個(gè) VPGXG五肽單元序列，五肽單元第 4個(gè)氨基酸殘基組成為K、V、F，且五肽單元第4個(gè)殘基中含2個(gè) K，16個(gè)V，2個(gè)F，比例為1:8:1。

1.2 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基

表達(dá)宿主菌E. coli BL21 (DE3) 與pUC-19-ELPs及修飾后的pET-22b(+) 為本實(shí)驗(yàn)室保存，表達(dá)載體pET-22b(+) 為上海捷瑞生物工程有限公司惠贈(zèng)。的修飾過(guò)程為用替換原始 pET-22b(+) 的 NdeⅠ與 EcoRⅠ酶切位點(diǎn)之間的序列。

1.3 主要工具酶及試劑

限制性?xún)?nèi)切酶PflMⅠ、BglⅠ、NdeⅠ、EcoRⅠ與 SfiⅠ購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，蛋白質(zhì)Maker SM1861為Fermentas公司產(chǎn)品，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，聚乙烯亞胺購(gòu)于Sigma公司，透析袋為美國(guó)聯(lián)合碳化公司產(chǎn)品，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.4 ELPs的原核表達(dá)載體構(gòu)建

本文所涉及到的分子生物學(xué)技術(shù)，如感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取和酶切等方法均參考文獻(xiàn)[9]。用 PflMⅠ與BglⅠ雙酶切pUC-19-ELPs，獲得 ELPs片段基因，將此片段基因插入到經(jīng) SfiⅠ酶切后 pET-22b(+) 修飾表達(dá)載體。重組質(zhì)粒命名為pET-22b-ELPs，測(cè)序鑒定由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.5 ELP[KV8F-20] 表達(dá)與純化

含有pET-22b-ELPs重組質(zhì)粒的BL21工程菌按1∶100的接種量接種到含100 μg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中 (每升TB培養(yǎng)基中含12 g蛋白胨，24 g酵母浸提物，2.31 g磷酸氫二鉀，12.54 g磷酸二氫鉀，4 mL甘油)，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo) (終濃度為1 mmol/L)，誘導(dǎo) 3 h，4 ℃、4 000 r/min離心 15 min，收獲菌體，用預(yù)冷的PBS緩沖液 (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.2 mmol/L NaH2PO4，1.4 mmol/L KH2PO4，pH為7.3) 重懸菌體，然后置冰浴中超聲破碎 (超聲2 s，間隔2 s，共4 min)。

ELPs純化采用ITC (Inverse transition cycling，可逆相變循環(huán))，即在大腸桿菌破碎液，向其加入聚乙烯亞胺 (終濃度為0.5%) 以去除核酸；4 ℃、13 000 r/min離心15min，取上清；向上清液中添加 NaCl 至終濃度為 2 mol/L，37 ℃水浴15 min后，13 000 r/min離心15 min，去上清；向沉淀中加入預(yù)冷的PBS 溶解沉淀，冰浴15 min后，4 ℃、13 000 r/min離心 15 min；向上清液中再添加NaCl至終濃度為 2 mol/L，37 ℃水浴 15 min后，13 000 r/min離心15 min，去上清；向沉淀中加入預(yù)冷的PBS溶解沉淀，冰浴15 min，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，收集上清液，以上過(guò)程為兩輪ITC。ELPs的純度與分子量通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證。

1.6 ELP[KV8F-20] 的定量

采用紫外分光光計(jì)測(cè)定Trp在280 nm處的消光系數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)定ELP[KV8F-20] 在280 nm的消光系數(shù)，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，從而可以對(duì)ELPs濃度進(jìn)行定量[10]。

1.7 ELP[KV8F-20] 相變溫度測(cè)定及鹽對(duì)其相變溫度影響的測(cè)定

測(cè)定ELP[KV8F-20] 相變溫度參考文獻(xiàn)[2]，即：測(cè)定 10 ℃~95 ℃ E LPs 的PBS溶液 (ELPs終濃度為25 μmol/L) 在波長(zhǎng)為350 nm處的濁度，升溫速率為1 ℃/min。

鹽對(duì) ELP[KV8F-20] 相變溫度影響的測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]，即將鹽溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.9)，配制各種鹽的濃度梯度。將冷凍干燥后的 ELPs溶解于鹽濃度中，ELPs的終濃度為25 μmol/L，并測(cè)定其在波長(zhǎng)為350 nm處不同溫度下的濁度。

1.8 相變溫度定義

相變溫度為OD350最大值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PUC-19-ELPs的酶切及ELPs基因片段回收

依據(jù) ELP[KV8F-20]的氨基酸序列 (100個(gè)氨基酸)，考慮大腸桿菌的密碼子使用情況，從頭設(shè)計(jì)其基因序列 (300 bp)，將其連入克隆載體pUC-19，經(jīng)測(cè)序列，pUC-19-ELPs質(zhì)粒構(gòu)建正確。利用pflMⅠ與 BglⅠ對(duì) ELP[KV8F-20]基因片段回收，回收結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)線(xiàn)性克隆載體片段與大小為300 bp的基因片段，符合預(yù)期大小；再將此基因?qū)氲接肧fiⅠ酶切修飾后的pET-22 b(+) 表達(dá)載體中[2]，構(gòu)建pET-22 b(+)-ELPs表達(dá)載體，使用Nde I與EcoR I對(duì)該表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，可見(jiàn)線(xiàn)性表達(dá)載體片段和大小為 332 bp的基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致；結(jié)合測(cè)序結(jié)果，表明表達(dá)載體構(gòu)建正確。之后，將該pET-22 b(+)-ELPs導(dǎo)入到E. coli BL21 (DE3) 宿主菌中，構(gòu)建工程菌。

2.2 ELPs的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

圖1 pflM Ι與Bgl Ι酶切回收ELP基因Fig. 1 Recovery ELP gene with digestion by pflM I and Bgl I. 1: pET-22(b)-ELP digested by pflM I and Bgl I; 2: DNA marker.

圖2 重組pET-22(b)-ELPs的酶切鑒定Fig. 2 Identification of pET-22(b)-ELPs with digestion by Nde I and EcoR I. 1: pET-22(b)-ELPs digested by Nde I and EcoR I; 2: DNA marker.

含有 pET-22b(+)-ELPs重組質(zhì)粒的 BL21工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體，并細(xì)胞破碎后，采用ITC純化，純化結(jié)果表明在11 kDa處有一條帶，比 ELP[KV8F-20] 理論分子量大 20%，與相關(guān)的ELPs報(bào)道吻合[10,12]。

圖3結(jié)果表明，兩輪ITC之后，與細(xì)胞破碎液相比，目的蛋白質(zhì)在純化的過(guò)程中并沒(méi)有太大損失，因而可認(rèn)為 ITC可以保證目的蛋白回收率。由圖 4可知，經(jīng)兩輪ITC之后，在11 kDa處有單一條帶，已達(dá)到純化目的，此外，ITC過(guò)程也是一個(gè)蛋白濃縮的過(guò)程。

圖3 表達(dá)純化的ELPsFig. 3 Expression and purification of the ELPs. 1: the purified ELPs after two rounds ITC; 2: the purified ELPs after one rounds ITC; 3: total proteins after induction; 4: protein marker.

圖4 使用足量與少量PBS溶解純化后ELPs沉淀Fig. 4 ELPs dissolved in adequate and small amount of PBS.1: protein marker; 2: purified ELPs were dissolved in adequate amount of PBS; 3: purified ELPs were dissolved in small amount of PBS.

2.3 ELPs相變溫度的測(cè)定及鹽對(duì)其相變溫度的影響

由圖5可知，在ELPs的相變發(fā)生階段，溫度上升2 ℃~3 ℃時(shí)，導(dǎo)致ELPs混濁度急劇的增加，關(guān)于ELPs相變機(jī)理，目前處于爭(zhēng)論階段，有一種觀點(diǎn)認(rèn)為溫度升高，會(huì)破壞水分子與ELPs之間的水合作用，導(dǎo)致 ELPs溶解度驟變[11]。圖 6表明 ELPs的相變溫度與 ELPs的濃度呈反比關(guān)系，故 ELPs表達(dá)量越大，ELPs濃度越高，相變溫度越低，越有利于ELPs的純化。此外，ELPs的相變溫度與ELPs五肽重復(fù)序列單元中第 4個(gè)殘基 (Xaa) 的種類(lèi)、ELPs序列長(zhǎng)度、ELPs的分子量相關(guān)[13]。

圖5 含100 μmol/L的ELP[KV8F-20] PBS溶液的混濁度與溫度關(guān)系Fig. 5 Turbidity profiles for 100 μmol/L ELP[KV8F-20]concentration in PBS.

圖6 ELP[KV8F-20] Tt與濃度關(guān)系Fig. 6 Ttas a function of concentration for ELP[KV8F-20].

測(cè)定5種陰離子與3種陽(yáng)離子對(duì)類(lèi)彈性蛋白相變溫度的影響，依據(jù)霍夫邁斯特離子序[14](Hofmeister series)，陰離子陽(yáng)離子本研究所考察3種陽(yáng)離子及5種陰離子影響類(lèi)彈性蛋白相變溫度順序。圖 8結(jié)果表明，5種陰離子的鈉鹽影響類(lèi)彈性蛋白相變溫度順序均與霍夫邁斯特離子序相符合 (銨鹽與鉀鹽未列出，其影響趨勢(shì)與鈉鹽一致)。圖7結(jié)果表明，3種陽(yáng)離子的硫酸鹽 (碳酸鹽、磷酸二氫鹽、氯化物、硝酸鹽影響 Tt趨勢(shì)與硫酸鹽一致) 對(duì)影響類(lèi)彈性蛋白相變溫度順序卻為 NH4+＜K+＜Na+，造成這種差異，可能是本研究所設(shè)計(jì)的ELPs中含有苯丙氨酸殘基 (F) 與賴(lài)氨酸殘基 (K)有關(guān)，賴(lài)氨酸殘基的存在會(huì)使多肽產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)(Screening effects)，而F的存在會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)離子-π相互作用[11]。

圖7 三種硫酸鹽對(duì)ELP[KV8F-20] 相變溫度的影響Fig. 7 Transition temperature vs salt concentration curves for three sulfatets with ELP[KV8F-20].

圖8 五種鈉鹽對(duì)ELP[KV8F-20] 相變溫度的影響Fig. 8 Transition temperature vs salt concentration curves for five sodium salts with ELP[KV8F-20].

3 討論

類(lèi)彈性蛋白多肽是一種具有彈性功能且對(duì)環(huán)境非常敏感的生物高分子，利用類(lèi)彈性蛋白的可逆相變特性，使其在蛋白純化、作為藥物載體、組織工程等方面得到廣泛的應(yīng)用[15]。

與類(lèi)彈性蛋白進(jìn)行融合表達(dá)的重組蛋白也具有可逆相變特性，因而也可以采用 ITC純化重組蛋白[16]。采用ITC純化蛋白有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)[17]：1)無(wú)需與色譜相關(guān)的色譜填料及設(shè)備，純化成本大幅度下降，這種純化方式可以規(guī)模化放大 (純化的蛋白量可以達(dá)到千克級(jí)別)；2) ITC的過(guò)程中分離與回收的條件較為溫和，只需適當(dāng)改變溫度與離子強(qiáng)度；3) 采用ITC純化蛋白這種純化方式速度快，方法簡(jiǎn)單，只需幾次離心步驟；4) ITC是很容易應(yīng)用于到從不同的細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)純化蛋白，因?yàn)榈鞍准兓侵萍s蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能研究與藥物篩選主要環(huán)節(jié)；5) ITC中的離心沉淀步驟也是一個(gè)蛋白濃縮富集過(guò)程，無(wú)需干燥；6) 目的蛋白回收率較高，采用ITC純化，回收率可以達(dá)到75%[18]。有研究者認(rèn)為，這種純化方式將給重組蛋白的分離純化帶來(lái)革命性變化[16]。鑒于ITC純化蛋白簡(jiǎn)單且快速性，有理由相信這種蛋白純化方式比較容易從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大到工業(yè)規(guī)模。

本研究從頭設(shè)計(jì)了一種新型的僅有 20個(gè)五肽單元的ELPs序列，通過(guò)考察不同鹽對(duì)其相變溫度影響，發(fā)現(xiàn)能大幅度降低相變溫度。雖然銨鹽也能顯著降低相變溫度，但是與鈉鹽相比，銨鹽加入會(huì)造成很多蛋白的鹽析，從而在目標(biāo)蛋白中引入了更多的雜蛋白，對(duì)后續(xù)的分離純化不利[16]。與常規(guī)的ELPs相比 (如 ELP[V5]，ELP[V5A2G3]，ELP[V1A8G7])，本研究所設(shè)計(jì)的 ELPs蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度更短 (常規(guī)的ELPs序列一般至少需有60個(gè)以上五肽重復(fù)單元，才具有較低的相變溫度)[10]；對(duì)鹽濃度更為敏感；且賴(lài)氨酸的相對(duì)含量更低，這有助于提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量[18]并可能與ELPs產(chǎn)生的tT?(NaCl) 效應(yīng)更低有關(guān)[2]。通過(guò)對(duì)鹽離子的進(jìn)一步優(yōu)化，此ELPs序列有望開(kāi)發(fā)成一個(gè)新的重組蛋白純化標(biāo)簽。

目前，國(guó)內(nèi)鮮有 ELPs的研究報(bào)道[20]，而國(guó)外則相對(duì)較深入[15]。本研究所設(shè)計(jì)的 ELPs因其分子量較小，對(duì)鈉鹽非常敏感，產(chǎn)量較高，可望作為一種新型的純化標(biāo)簽，為今后重組蛋白的分離純化帶來(lái)更多的選擇，相關(guān)的研究仍在不斷深入進(jìn)行中。

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De novo design, non-chromatographic purification and salt-effect of elastin-like polypeptides

Kaizong Huang, Jingjing Li, Wei Li, Huihua Ge, Wenyan Wang, and Guangya Zhang
Department of Bioengineering and Biotechnology, Huaqiao University, Xiamen 362021, China

Received: June 13, 2010; Accepted: October 20, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 20806031), Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2009J01030).Research Foundation for Advanced Talents of Huaqiao University (No. 10BS220).

Corresponding author: Guangya Zhang. Tel: +86-595-22690290; E-mail: zhgyghh@hqu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 20806031)，福建省自然科學(xué)基金 (No. 2009J01030)，華僑大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目 (No. 10BS220) 資助。