劉衛(wèi)今, 蔣向輝, 黃 勇, 殷 妮

(懷化學(xué)院11生命科學(xué)系; 2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 31湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南懷化 418008)

不同柑橘品種耐冷內(nèi)生菌的分離與初步鑒定

劉衛(wèi)今1,2,3, 蔣向輝1,2,3, 黃 勇1, 殷 妮1

(懷化學(xué)院11生命科學(xué)系; 2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 31湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南懷化 418008)

柑橘內(nèi)生菌資源很豐富,柑橘的凍害與病害的防治及果實(shí)品質(zhì)跟內(nèi)生菌有很大關(guān)系1通過對8個(gè)不同柑橘品種的組織表面消毒和耐冷處理,采用稀釋涂布平板法與劃線分離法,從中分離出8種耐冷內(nèi)生菌1運(yùn)用傳統(tǒng)的分類鑒定方法,對分離到的耐冷內(nèi)生菌進(jìn)行了革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動(dòng)性檢查,得到了各耐冷內(nèi)生菌的相關(guān)特征1

柑橘; 耐冷內(nèi)生菌; 分離與鑒定

近幾年來,植物內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于植物病害防治方面的研究逐漸深入,已成為植物病害生物防治的主要藥源之一[1]1植物內(nèi)生細(xì)菌不僅將植物作為其棲息場所,而且對寄主植物有促生、防病、內(nèi)生聯(lián)合固氮等廣泛的生物學(xué)作用,是植物病害生物防治、內(nèi)生聯(lián)合固氮菌篩選、誘導(dǎo)抗病性及轉(zhuǎn)基因載體等功能的天然菌源,具有較高的理論研究價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,已成為微生物學(xué)和植物學(xué)學(xué)科的研究熱點(diǎn)1孔慶科等[2]認(rèn)為:感染內(nèi)生菌的植物宿主往往具有生長快速、抗逆境、抗病害、抗動(dòng)物危害等優(yōu)勢,比未感染植株更具生存競爭力1在內(nèi)生菌-植物宿主-食草動(dòng)物生態(tài)系統(tǒng)中,植物內(nèi)生菌扮演著前所未知的重要生態(tài)學(xué)作用1發(fā)揮這些作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是內(nèi)生菌產(chǎn)生的豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物,它們具有多種生物活性,在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力1有關(guān)研究結(jié)果表明柑橘內(nèi)生細(xì)菌資源豐富,而且多數(shù)對植物病原真菌具有一定的拮抗作用,可作為生物防治的資源進(jìn)一步用于防病和保鮮1鄭重祿等[3]的有關(guān)試驗(yàn)雖然初步篩選出對柑橘炭疽病具有防治作用的內(nèi)生菌,但對其定殖性和可用于防病保鮮的商品應(yīng)用價(jià)值仍然有待深入研究1

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在湖南省麻陽縣園藝場的柑類、橙類、柚類中選8個(gè)代表種,即柑、臍橙、沙塘桔、金錢橘、沙田柚、血橙、葡萄柚、冰糖柑1

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐冷內(nèi)生菌分離

1.2.1.1 培養(yǎng)基制備

分別制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基制備、高氏一號(hào)培養(yǎng)基1

1.2.1.2 取樣

在2008年冰災(zāi)中耐冷性表現(xiàn)較好的柑橘園中,采用5點(diǎn)取樣法(東、南、西、北、中),每點(diǎn)選取供試樹1株,取2個(gè)健壯、外觀漂亮且果體中等以上的果實(shí)作為分離材料,每個(gè)品種取樣10個(gè)樣本,將所采樣本分種類分別裝入食品保鮮袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室1

1.2.1.3 預(yù)處理

取果實(shí)進(jìn)行組織表面清毒,即用75%的酒精浸泡1 min,再用011%的升汞溶液浸泡5 min,無菌水洗3次,晾干,放入冰箱中經(jīng)耐冷處理10 d之后從冰箱中取出,再進(jìn)行表面消毒1實(shí)驗(yàn)中設(shè)立對照:吸取少量表面消毒中最后一次沖洗材料的無菌水,涂布于培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng)若無微生物長出,表明表面消毒徹底1

取各品種柑橘6個(gè)經(jīng)表面消毒后放入4℃冰箱中分別冷處理4、6、8、10、12、14d,取出后再次表面消毒,取中果肉分別培養(yǎng)在標(biāo)號(hào)D4、D6、D8、D10、D12、D14的平板中,觀察內(nèi)生菌生長情況1

1.2.2 內(nèi)生菌的純化

在超凈工作平臺(tái)上切取果實(shí)的果皮,果肉(1 cm ×1 cm),分別裝入高氏一號(hào)、LB培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待邊緣長出細(xì)菌后,挑取不同形態(tài)的菌落,進(jìn)行培養(yǎng)1繼而通過多次平板劃線得到單個(gè)菌株以后移入試管斜面保存1

1.2.3 菌落形態(tài)特征的觀察

將菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h后,觀察其在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的生長情況,記錄其菌落形態(tài)特征,再挑出菌株,進(jìn)行革蘭氏染色、莢膜觀察、芽孢檢查、運(yùn)動(dòng)性檢查和需氧特征觀察1

2 結(jié)果與分析

2.1 耐冷內(nèi)生菌分離

2.1.1 耐冷時(shí)間

表1 各品種柑橘在不同冷處理時(shí)間的長菌情況

由表1可知不同柑橘品種冷處理的合適時(shí)間為:沙田柚和葡萄柚的冷處理14 d,其他柑橘品種的冷處理時(shí)間10 d較為合適1

2.1.2 不同分離方法效果比較

2.1.2.1 通過稀釋涂布平板法得到的內(nèi)生菌分別為:

2.1.2.2 通過劃線分離法得到的內(nèi)生菌分別為:

從臍橙中分離出2號(hào)細(xì)菌;從沙塘桔中分離出3號(hào)細(xì)菌;從沙田柚中分離出5號(hào)細(xì)菌;從血橙中分離出6號(hào)細(xì)菌;從葡萄柚中分離出7號(hào)細(xì)菌;從冰糖柑中分離出8號(hào)細(xì)菌1從表2的結(jié)果可知:稀釋涂布平板法沒有分離出3

表2 兩種分離方法比較

號(hào)和5號(hào),平板劃線分離沒有分離出1號(hào)和4號(hào),單憑一種分離方法不能達(dá)到完全分離的效果,需經(jīng)兩種或兩種以上的方法才能分離出理想的內(nèi)生菌1

2.1.3 分離結(jié)果

表3 各種培養(yǎng)基分離結(jié)果比較

由表3可知,在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上沒有分離出4號(hào)和7號(hào)菌株,在LB培養(yǎng)基平板上沒有分離出2號(hào)菌株,高氏一號(hào)培養(yǎng)基沒有分離到任何菌株,這說明各細(xì)菌所需的營養(yǎng)條件不完全相同1

2.1.4 同種細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況比較

表4 不同培養(yǎng)基中的生長情況

2、5、6、8號(hào)細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上長勢明顯好于LB培養(yǎng)基,菌落較后者大,生長速度快11、3、4、7號(hào)細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中長勢較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基好,菌落較大,生長速度快1

2.1.5 在柑橘不同部位內(nèi)生菌的存在情況

表5 在果皮與果肉中的情況

由表5可知在3號(hào),4號(hào),8號(hào)菌在果皮中沒有出現(xiàn),而在果肉中都有出現(xiàn),原因可能是在樣品表面消毒時(shí)果皮中內(nèi)生菌已被殺死1

2.1.6 小結(jié)

本試驗(yàn)從經(jīng)耐冷處理后的果皮與果肉中分離出8種內(nèi)生細(xì)菌,內(nèi)生放線菌的分離培養(yǎng)比較困難,沒有分離出真菌和放線菌1

2.2 耐冷內(nèi)生菌的鑒定

2.2.1 在營養(yǎng)瓊脂平板上的生長情況

從菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上的生長情況可知各菌株的菌落形態(tài)特征(見表6),1號(hào)、2號(hào)、7號(hào)、8號(hào)菌株的菌落形態(tài)基本相同,都為乳白色,表面凸起,呈奶油狀,邊緣整齊,粘稠,但是1號(hào),和7號(hào),菌落半透明,而2號(hào)和8號(hào)菌落不透明13號(hào)和5號(hào)菌株的菌落都為乳白色,表面凸起,呈奶油狀,邊緣不整齊,其中3號(hào),菌株的菌落不透明,不粘,較為干燥,5號(hào)的菌落半透明,粘稠,較為濕潤14號(hào)和6號(hào)菌株的菌落都呈灰白色,表面凸起,半透明,邊緣不整齊,4號(hào)和6號(hào)菌株的菌落表面都不光滑,4號(hào)表面為絨毛狀,相對較為濕潤,粘稠,6號(hào)表面為纖毛狀,干燥,不粘,且邊緣呈鋸齒狀1

表6 菌株在營養(yǎng)瓊脂平板表面生長的菌落形態(tài)特征

圖1 各菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基上的生長情況

2.2.2 菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

2.2.2.1 革蘭氏染色結(jié)果

據(jù)圖2可知:3號(hào)和6號(hào)中的菌體被染成紅色,其余圖中菌體為深紫色1可見從普通甜橙和血橙中分離出來的菌株為G-菌外,從柑、臍橙、金錢橘、沙田柚、葡萄柚和冰糖橙分離出來的菌株全為G+1在觀察菌體的革蘭氏染色情況時(shí),還觀察到一些為空泡狀構(gòu)造1從1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和8號(hào)中觀察到的空泡狀構(gòu)造為橢圓形;從2號(hào)中觀察到的空泡狀構(gòu)造呈柱圓形;從4號(hào)中觀察到的空泡狀構(gòu)造為圓形;從5號(hào)中觀察到的空泡狀構(gòu)造為卵圓形1可見1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和8號(hào)菌株能鹽成的芽孢呈橢圓形;2號(hào)和4號(hào)菌株的芽孢呈柱圓形;5號(hào)菌株的芽孢呈卵圓形1

圖2 各耐冷內(nèi)生菌的革蘭氏染色圖

2.2.2.2 莢膜染色結(jié)果

通過莢膜染色后,可觀察到1號(hào)、5號(hào)和8號(hào)菌株染色后可以觀察到黑色的背景與紅色的菌體之間襯托出了無色的一圈,鎮(zhèn)1、5、8號(hào)菌株有莢膜,其他的菌株沒有莢膜1

2.2.2.3 芽孢染色結(jié)果

從革蘭氏染色結(jié)果中可以觀察到芽孢的存在,在芽孢染色中,可以更清楚的觀察到芽孢的形態(tài)特征1通過對芽孢染色裝片的觀察可知:1號(hào)、3號(hào)、7號(hào)和8號(hào)菌株有膨大的孢囊,在膨大的孢囊內(nèi)有橢圓形的芽孢;2號(hào)菌株芽孢為柱形;4號(hào)菌株芽孢為圓形;5號(hào)菌株的芽孢為卵圓形;6號(hào)菌株芽孢為橢圓形1

2.2.2.4 運(yùn)動(dòng)性檢查

通過運(yùn)動(dòng)性檢查實(shí)驗(yàn),可以觀察到所有菌株的若干個(gè)菌體同時(shí)向不同方向運(yùn)動(dòng),并且各運(yùn)動(dòng)菌體之間的距離不斷發(fā)生變化,由此可見,從8中柑橘中分別分離出來的8種菌株都具有運(yùn)動(dòng)性1

2.2.2.5 需氧方式

1號(hào)菌株在厭氧培養(yǎng)基上沿穿刺線生長良好,上部和下部生長一致,呈線狀;2號(hào)菌株在厭氧培養(yǎng)基上沿穿刺線生長良好,上下部生長一致,呈線狀;3號(hào)菌株在厭氧培養(yǎng)基上沿穿刺線生長良好,上下部生長一致,呈線狀;4號(hào)菌株在厭氧培養(yǎng)基上,僅表面生長良好,下部不生長;5號(hào)菌株在厭氧培養(yǎng)基上沿穿刺線生長良好,上部和下部生長一致,呈線狀;6號(hào)菌株在厭氧培養(yǎng)基上沿穿刺生長良好,上部和下部生長一致,呈毛絨狀;7號(hào)菌株在厭氧培養(yǎng)基上,僅表面生長良好,下部不生長;8號(hào)菌株在厭氧培養(yǎng)基上,僅表面生長良好,下部不生長;由于1號(hào)菌株、2號(hào)菌株、3號(hào)菌株、5號(hào)菌株、6號(hào)菌株在經(jīng)穿刺的半固體培養(yǎng)基上,上、下部生長一致,則提示這些菌株可能是兼性厭氧菌;4號(hào)菌株、7號(hào)菌株和8號(hào)菌株在經(jīng)穿刺的半固體培養(yǎng)基上,上部生長好,下部基本不生長,則提示這些菌株可能為專性好氧菌1

2.2.6 小結(jié)

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,各耐冷內(nèi)生菌形態(tài)特性總結(jié)如下表1

表7 各耐冷內(nèi)生菌形態(tài)特性總結(jié)

運(yùn)用傳統(tǒng)鑒定方法鑒定(細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、運(yùn)動(dòng)性)得到了各耐冷內(nèi)生菌形態(tài)特性特征,與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]所列的細(xì)菌菌株形態(tài)學(xué)和生理生化性狀特征進(jìn)行對比可知,從8種柑橘中分離出來的8種耐冷內(nèi)生菌全都產(chǎn)生芽孢,為產(chǎn)芽孢細(xì)菌1由8種細(xì)菌在厭氧培養(yǎng)基中的生長情況可知此8種細(xì)菌為兼性厭氧菌或好氧菌,可知此8種細(xì)菌分別屬于雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicycobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、硫芽孢桿菌屬(Sulfidobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)這8個(gè)屬1

表8 初步鑒定結(jié)論

4 討 論

4.1 關(guān)于內(nèi)生菌分離方法

目前植物內(nèi)生菌分離方法大多數(shù)采用常規(guī)表面消毒法,本研究為確保所分離到的微生物為植物體內(nèi)生菌,采用的表面消毒比一般組織培養(yǎng)消毒更為嚴(yán)格,并對所消毒材料沖洗后的最后一次無菌水進(jìn)行涂板培養(yǎng),如在2～3 d內(nèi)沒有菌落產(chǎn)生,則認(rèn)為該材料消毒徹底,證明所分離到的為內(nèi)生菌1但用此消毒方法也易于殺死植物體內(nèi)微生物,因而所分離到的內(nèi)生菌種類與數(shù)量可能比植物體內(nèi)所含的要少1在進(jìn)行內(nèi)生菌分離的過程中,掌握適宜的材料消毒時(shí)間對最終分離到的內(nèi)生菌的數(shù)量和種類都具有重要作用1

耐冷時(shí)間的確定是根據(jù)各品種柑橘的果實(shí)大小,與果皮厚度不同來設(shè)的冷處理時(shí)間,冷處理的目的是從柑橘中篩選出優(yōu)勢的內(nèi)生菌,以從一種柑橘中分離出1～2種內(nèi)生菌為宜1不同分離方法達(dá)到的分離效果不完全相同,一種方法可能達(dá)不到完全分離的效果,該研究通過兩種分離方法來進(jìn)行分離,以達(dá)到互補(bǔ)的效果1

在內(nèi)生菌的分離過程中,所用培養(yǎng)基均為常規(guī)分離用的培養(yǎng)基,因而不能保證所有生活在柑橘果實(shí)內(nèi)的微生物全被分離出來,可能有的微生物不能在人工培養(yǎng)基上生長1耐冷內(nèi)生菌在不同培養(yǎng)基中的生長情況不凈相同,有的在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上長勢良好,在LB培養(yǎng)基上長勢較差,有的則在LB培養(yǎng)基中長勢良好,在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上長勢較差1這是因?yàn)楦鞣N細(xì)菌所需的營養(yǎng)條件不相同,從而導(dǎo)致這種現(xiàn)象的產(chǎn)生1本研究從經(jīng)耐冷處理后的果皮與果肉中分離出8種內(nèi)生細(xì)菌,內(nèi)生放線菌的分離培養(yǎng)比較困難,沒有分離出真菌和放線菌,具體原因有待進(jìn)一步研究1 412 關(guān)于內(nèi)生菌鑒定

傳統(tǒng)的內(nèi)生菌鑒定法以菌株的菌落形態(tài)(菌落顏色,表面特征……)、細(xì)菌形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢檢查、莢膜染色等特征為依據(jù)來識(shí)別[5]1但由于傳統(tǒng)鑒定方法存在項(xiàng)目眾多、操作繁瑣、需要分段進(jìn)行、耗時(shí)長且存在一定的局限性等缺點(diǎn),極有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確,例如在培養(yǎng)基中不能形成孢子的真菌,必須采用其他方法進(jìn)行檢測和鑒定1并且內(nèi)生菌長期處于共生生活中,會(huì)發(fā)生變異而失去典型特征,例如產(chǎn)生孢子的能力退化,只形成菌絲等,這樣會(huì)導(dǎo)致其菌落形態(tài)等特征和典型菌株的差異存在[6],造成鑒定困難或結(jié)果不準(zhǔn)確等1傳統(tǒng)的分類鑒定不僅不能鑒定所有的內(nèi)生菌,鑒定結(jié)果也肯可能出現(xiàn)一些偏差,雖然科技在不斷進(jìn)步,新的先進(jìn)的鑒定方法也不斷出現(xiàn),但是傳統(tǒng)的鑒定結(jié)果仍然是描述種屬特征所必不可少的依據(jù)1

植物內(nèi)生菌分布廣,種類多,據(jù)何美仙[7]等人的研究表明內(nèi)生菌可增強(qiáng)宿主對病原細(xì)菌和真菌的抗性,保護(hù)宿主免受危害,對植物的生長發(fā)育具有重要的作用,感染內(nèi)生菌的植物宿主往往具有生長快速、抗逆境、抗病害、抗動(dòng)物危害等優(yōu)勢,比未感染植株更具生存競爭力1在內(nèi)生菌——植物宿主——食草動(dòng)物生態(tài)系統(tǒng)中,植物內(nèi)生菌扮演著前所未知的重要生態(tài)學(xué)作用1植物內(nèi)生菌的研究正蓬勃地開展起來,有著廣闊的發(fā)展前景,但在研究和應(yīng)用的過程中也顯現(xiàn)出了如用于生物防治使周圍環(huán)境及植物體的微生態(tài)環(huán)境都對內(nèi)生菌的生長和作用的發(fā)揮存在影響,使防治效果不穩(wěn)定;能產(chǎn)生有醫(yī)療作用的活性物質(zhì)的內(nèi)生菌往往培養(yǎng)成本高,活性物質(zhì)產(chǎn)量低等一些問題1而且,目前植物內(nèi)生菌的作用機(jī)理的研究也有待深化1植物內(nèi)生菌相對來說開發(fā)較少、次生代謝產(chǎn)物豐富,合理開發(fā)利用植物內(nèi)生菌資源,從內(nèi)生菌中尋找新的活性代謝產(chǎn)物,將成為今后研究的重點(diǎn)1

[1]劉云霞,張青文,周明胖,等.植物保護(hù)21世紀(jì)展望[M].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,1998.

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[6]戴傳超,余伯陽.驅(qū)殺菜青蟲的內(nèi)生菌鑒定與化合物研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(4):694-697.

[7]何美仙.植物內(nèi)生真菌作為生防因子的研究進(jìn)展[J].植物保護(hù),2005,31(1):10-14.

Abstract:The endogenous bacteria resources is very rich inCitrus reticulataBlanco1,Citrus reticulataBlanco1disease control is closely related to the fruit quality,and have very big concern with endogenous bacteria1By surface sterilization and cold treatment,we isolated eight cold resistant endogenous bacteria,the result display the bacterial species in diffferentCitrus reticulataBlanco1were different1Based on the main shape of colony and individual,and the physiology and biochemistry character of bacteria,the species of eight cold resistant endogenous bacterias were identified1

Key words:Citrus reticulataBlanco1; Cold Endurance Endophytic; Isolation and Identification

Isolation and Identification of Cold Endurance Endophytic in DifferentCitrus ReticulataBlanco1Varieties

LIU Wei-jin1,2,3, JIANG Xiang-hui1,2,3, HUANG Y ong1, YINGNi1
(1.Department of Life Science; 2.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources; 31Key Laboratory of Hunan Higher Education for Hunan-western Medicinal Plant and Ethnobotany, Huaihua University,Huaihua,Hunan 418008)

Q93-331

A

1671-9743(2011)02-0037-06

2011-02-13

湖南省教育廳資助項(xiàng)目(09C755);懷化學(xué)院資助項(xiàng)目(HHUY2008-12)1

劉衛(wèi)今(1970-),男,湖南衡陽人,懷化學(xué)院副教授,主要研究微生物技術(shù)1