覃仁安，張超群，余小平，胡 華，周德生

復(fù)方丹參片主要由丹參、三七、冰片等組成。具有活血化瘀、理氣止痛等功效，臨床用于胸中憋悶、心絞痛，療效良好［1］。目前復(fù)方丹參片在治療腦缺血方面的實(shí)驗(yàn)報(bào)道為數(shù)不多，治療機(jī)制不詳。本研究采用Longa改良栓線法造成大鼠急性局灶性腦缺血模型，觀察復(fù)方丹參片對急性腦缺血大鼠治療效果，探討復(fù)方丹參片治療急性腦缺血大鼠的藥理作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 健康雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，清潔級）約190只，體重（205±10）g。復(fù)方丹參片由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z44023372）。灌胃劑量相當(dāng)于生藥0.630g／kg，為成人劑量的7.0倍。血栓通膠囊（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20025972），產(chǎn)自黑龍江省珍寶島制藥有限公司哈爾濱分公司，每粒裝0.18g（含三七總皂苷100mg）。

1.2 急性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕?參照Longa等腔內(nèi)線栓法［2］。動(dòng)物清醒后具備同側(cè)Horner氏征為研究對象。

1.3 分組與方法 將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、血栓通膠囊組、復(fù)方丹參片組。正常組不造模，假手術(shù)組不插線，其余步驟與模型組相同。分別于24h，3d，7d等時(shí)間點(diǎn)灌胃。正常組蒸餾水10mL／kg灌胃。模型組造模成功后，蒸餾水10mL／kg灌胃。血栓通膠囊組、復(fù)方丹參片低劑量組和復(fù)方丹參片高劑量組均各自在急性腦缺血大鼠造模前1h灌胃，以后每隔12h灌胃1次。分別在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后觀察神經(jīng)功能缺損評分，取腦組織，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.4 檢測指標(biāo) 在造模灌胃后24h、3d、7d觀察大鼠活動(dòng)情況、反應(yīng)狀況等一般癥狀。神經(jīng)功能缺損評分，按照Zausinger六分法［3］。缺血腦組織和對側(cè)相應(yīng)部位腦組織的病理學(xué)檢查（HE染色）。梗死體積百分率：TTC染色。將染色后腦組織切片攝影輸入計(jì)算機(jī)，AutoCAD軟件計(jì)算每個(gè)大腦8個(gè)腦片16個(gè)平面腦梗死面積和損傷側(cè)總面積，以梗死面積占損傷側(cè)大腦總面積的百分比作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。血管新生相關(guān)蛋白指標(biāo)測定，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的檢測采用免疫組織化學(xué)（ABC法）；血管生成素（Ang）－1、Ang－2的檢測陽性表達(dá)的部位采用Image－Pro Plus（IPP）圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，400倍高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察，結(jié)果以積分光密度值（IOD）表示，取其平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 非治療組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分無顯著變化。治療組評分隨著時(shí)間的推移逐漸提高，且復(fù)方丹參片組評分高于其余組。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分及腦組織梗死面積比較（±s）

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分及腦組織梗死面積比較（±s）

組別 n 神經(jīng)功能缺損（分） 梗死面積（%）正常組24h 10 5.00±0.00 0.05±0.01 3d 10 5.00±0.00 0.03±0.05 7d 10 5.00±0.00 0.00±0.04假手術(shù)組24h 10 5.00±0.00 1.00±0.01 3d 10 5.00±0.00 0.01±0.02 7d 10 5.00±0.00 0.08±0.04模型組24h 10 1.00±0.45 46.01±0.09 3d 10 0.95±0.11 47.22±0.01 7d 10 0.60±0.21 46.02±0.02血塞通膠囊組24h 10 1.53±0.45 46.92±0.02 3d 10 1.65±0.56 46.02±0.612）7d 10 1.60±0.53 44.03±0.132）復(fù)方丹參片組24h 10 1.43±0.411） 48.01±0.08 3d 10 1.85±0.781） 46.00±0.022）7d 10 2.13±0.651） 41.00±0.122）與血塞通膠囊組比較，1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.01

2.2 各組TTC染色法測腦梗死面積 腦組織TTC染色后，正常組織染成紅色，梗死灶染成白色。大腦中動(dòng)脈缺血再灌注后，梗死灶位于左側(cè)額葉、頂葉、顳葉皮層及新紋狀體外側(cè)部。正常組和假手術(shù)組大鼠的大腦切片經(jīng)TTC染色后未發(fā)現(xiàn)有腦梗死現(xiàn)象，模型組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)后的梗死面積無顯著變化。模型組、血塞通膠囊組和復(fù)方丹參片組在24h后梗死面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在3d和7d后血塞通膠囊組和復(fù)方丹參片組梗死面積均有不同程度的縮小，其中復(fù)方丹參片組梗死面積減少更為顯著（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 缺血腦組織和對側(cè)相應(yīng)部位腦組織的病理學(xué)檢查 正常組、假手術(shù)組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織病理形態(tài)學(xué)無明顯改變，神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核核膜完整，核仁明顯。模型組、血塞通膠囊組、復(fù)方丹參片組1d，光鏡下可見腦神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、正常，未見腦水腫和其他病變，3d、7d后均有不同程度的腦皮質(zhì)和側(cè)腦室旁多發(fā)性軟化灶形成，部分腦組織小血管中可見血栓栓子，軟化灶周圍腦組織水腫明顯。此病理性改變以模型組為重。造模后3d，模型組腦水腫仍很明顯，軟化灶內(nèi)還可見較多格子細(xì)胞；血塞通膠囊組軟化灶內(nèi)格子細(xì)胞更多，神經(jīng)元有不同程度的變性、壞死、脫失，并可見神經(jīng)元被吞噬現(xiàn)象，神經(jīng)元數(shù)量減少，并在其周邊區(qū)部位有小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。這種現(xiàn)象在復(fù)方丹參片組也會發(fā)現(xiàn)，但是相對比較輕微。模型組、血塞通膠囊組、復(fù)方丹參片組7d，模型組部分大鼠腦內(nèi)有軟化囊腫形成，囊壁有膠質(zhì)細(xì)胞增生、肉芽組織形成，部分大鼠腦組織中可見較多的格子細(xì)胞，也有部分大鼠腦組織內(nèi)有肉芽瘢痕形成。復(fù)方丹參片組除少數(shù)大鼠腦內(nèi)有未完全機(jī)化的軟化灶以外，大部分可見肉芽瘢痕形成，在保護(hù)神經(jīng)元與增強(qiáng)病變修復(fù)方面作用均較明顯。

2.4 血管新生因子的表達(dá) 正常組、假手術(shù)組大鼠腦組織梗死灶周圍對應(yīng)部位僅有少量的VEGF、bFGF表達(dá)，主要為為黃褐色胞漿著色。模型組、血塞通組、復(fù)方丹參片組表達(dá)增加，VEGF蛋白陽性表達(dá)主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其次為神經(jīng)細(xì)胞及血管，梗死灶周圍較核心顯著；bFGF在正常腦組織皮層低水平表達(dá)。bFGF蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)水平較高，在神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)較弱。二者的陽性表達(dá)在3d后達(dá)到高峰，7d后顯著下降。復(fù)方丹參片組的陽性表達(dá)明顯優(yōu)于血塞通膠囊組（P＜0.05）。顯微鏡下觀察Ang免疫組化染色結(jié)果顯示，正常大鼠腦內(nèi)幾乎所有區(qū)域均為淡棕色，其中缺血邊緣組織染色較強(qiáng)。模型組大鼠腦缺血24h后大腦中動(dòng)脈供血區(qū)皮層表達(dá)明顯增強(qiáng)（OD值0.204 01）；3d后Ang在上述區(qū)域表達(dá)進(jìn)一步升高，達(dá)到最高值（OD值0.2491）；7d后大鼠上述區(qū)域Ang表達(dá)仍明顯高于正常組（OD值分別為0.214 00和0.210 02），但較再灌注24h組有所降低；在藥物治療組大鼠缺血區(qū)缺Ang表達(dá)更明顯。復(fù)方丹參片組Ang表達(dá)在3d組和7d組均明顯高于血塞通膠囊組（P＜0.05）。詳見表2、表3。

表2 VEGF、BFGF在各組鼠大腦白質(zhì)的表達(dá)（±s）

表2 VEGF、BFGF在各組鼠大腦白質(zhì)的表達(dá)（±s）

組別 n VEGF BFGF正常組24h 10 1.00±0.11 1.00±0.41 3d 10 0.00±0.01 1.00±0.12 7d 10 0.10±0.02 2.00±0.03假手術(shù)組24h 10 1.15±0.40 1.05±0.12 3d 10 0.16±0.21 1.76±0.51 7d 10 0.26±0.42 1.01±0.55模型組24h 10 19.55±1.01 17.01±0.59 3d 10 20.11±0.42 19.23±0.57 7d 10 20.35±0.87 15.95±0.33血塞通膠囊組24h 10 29.36±1.01 19.41±0.45 3d 10 32.65±1.04 22.96±0.57 7d 10 30.53±3.13 17.99±0.48復(fù)方丹參片組24h 10 30.56±1.261） 18.01±0.131）3d 10 35.96±1.561） 25.36±0.441）7d 10 21.75±0.361） 21.56±2.45與模型組比較，1）P＜0.05

表3 Ang－1、Ang－2在各組鼠大腦白質(zhì)的表達(dá)（IOD sum）

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性中風(fēng)是各種致病因素作用下發(fā)生的“腦絡(luò)瘀阻”，其病理因素有風(fēng)、火（熱）、痰（飲）、瘀、毒五種，病理關(guān)鍵是瘀血。治療性血管新生能有效地恢復(fù)腦組織血供，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡?；钛伸铕?，瘀血去則新血生，稱之“祛瘀生新”?！吧隆辈粌H是傳統(tǒng)意義上的生新血，而且還包含有“生新絡(luò)”的含義，瘀血去，則新血及新絡(luò)生，生新又反過來促進(jìn)瘀血的祛除。

血管新生是指在機(jī)體生長發(fā)育過程中或創(chuàng)傷修復(fù)、缺血缺氧和炎癥等情況下原有微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等形成新毛細(xì)血管的過程［4］。VEGF具有特異性促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和血管生長的作用，且依據(jù)其濃度不同發(fā)揮的作用也不同，低濃度時(shí)血管新生占優(yōu)勢，高濃度時(shí)血管發(fā)生占優(yōu)勢［5］。bFGF是一種多效能的細(xì)胞生長因子，bFGF能在細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換中誘導(dǎo)并促進(jìn)G0、G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，從而實(shí)現(xiàn)成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的快速增殖與分化［6］。血管生成素是一組分泌型的細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子家族在血管重塑、胚胎血管發(fā)育、癌癥等研究熱點(diǎn)中起著重要作用，具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)新血管生成［7］，在血管生成過程中其調(diào)節(jié)和引導(dǎo)作用，防治血管畸形的發(fā)生。腦缺血患者腦內(nèi)新生血管數(shù)目越多則生存時(shí)間越長［8］。

本實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)方丹參片可提高急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評分，改善缺血組織的病理形態(tài)，縮小腦梗死面積，提高缺血腦組織的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF、bFGF）和血管生成素（Ang－1和Ang－2）水平，初步考慮復(fù)方丹參片以增加血管新生因子來促進(jìn)新生血管形成，但其具體作用機(jī)制及其環(huán)節(jié)，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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