邸煒鵬,王昭萍,于瑞海,周珊珊,顧玲玲,李 寧

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

氨海水與5-羥色胺對櫛孔扇貝解剖卵的體外促熟作用

邸煒鵬,王昭萍＊＊,于瑞海,周珊珊,顧玲玲,李 寧

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

研究氨海水與5-羥色胺(5-HT)對櫛孔扇貝解剖獲得卵母細胞的促熟作用。通過體外浸泡的方法處理櫛孔扇貝卵母細胞使其成熟,并完成人工受精。結(jié)果表明一定濃度的氨海水可顯著促使櫛孔扇貝卵母細胞生發(fā)泡破裂,但經(jīng)過氨處理的卵母細胞受精率卻不高;5-羥色胺不能誘導(dǎo)櫛孔扇貝卵母細胞生發(fā)泡破裂,但可有效地使已經(jīng)發(fā)生生發(fā)泡破裂的卵母細胞進一步成熟。先用氨海水處理然后用5-羥色胺處理可以得到最佳誘導(dǎo)效果,受精率可達(40.02±2.73)%。

櫛孔扇貝;體外成熟;氨海水;5-羥色胺

雙殼貝類的繁育過程中,常采用解剖取卵、人工授精的方法,以避免精液過多的現(xiàn)象[1]。然而,貝類的卵子多是分批成熟分批產(chǎn)出的,解剖獲得的卵子存在成熟度不夠及發(fā)育不同步現(xiàn)象,對其進行體外促熟是必要的。

目前關(guān)于貝類解剖卵的體外促熟研究報道不多,僅見于太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[2]、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)[3]、紫扇貝(A rgopecten purpuratus)[4]、硬殼蛤(Mercenaria mercenaria)[5]、浪蛤(S pisula)[6]等幾種貝類中。已有的研究結(jié)果表明海水浸泡、維生素、氨海水(Ammonia Seawater,AS)、5-羥色胺(5-HT)、組胺等對貝類的解剖卵都有一定的促熟作用。

櫛孔扇貝(Chlamys f arreri)是我國北方重要的養(yǎng)殖貝類,因其解剖卵無法完成受精作用,卵子都是通過自然產(chǎn)出或誘導(dǎo)排放的途徑獲得,迄今未有其解剖取卵、體外促熟的報道。本研究采用氨海水和5-羥色胺(5-HT)對櫛孔扇貝的解剖卵進行體外促熟研究,通過對生發(fā)泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD)情況和受精情況的分析來衡量2種試劑的促熟作用,探索扇貝解剖取卵、人工受精的可行性,最后通過氨和5-羥色胺的雙因子處理建立了櫛孔扇貝解剖獲卵的體外促熟技術(shù),該技術(shù)將在櫛孔扇貝的繁殖和遺傳操作中得到應(yīng)用,并且對于建立相關(guān)類型貝類卵母細胞的體外促熟技術(shù)均有借鑒。

1 材料與方法

1.1 精卵的獲得

實驗用櫛孔扇貝親貝為青島海區(qū)養(yǎng)殖的成熟2齡貝(殼長6.19 cm±0.5 cm,殼寬2.24 cm±0.2 cm,殼高6.65 cm±0.6 cm,體質(zhì)量54.86 g±3.5 g)。

親貝經(jīng)過暫養(yǎng)穩(wěn)定后,挑選發(fā)育良好的親貝,解剖獲得精卵[7]。將卵液用100目篩絹濾去較大組織塊后,再用500目篩絹去除組織液和微小雜質(zhì);精液用300目篩絹過濾,選用上層,并檢查精子活性。

1.2 卵母細胞的促熟

室溫(20℃)下,在幾支15 mL試管中加入等量卵液,再加入等量不同濃度的處理液,控制卵密度為500～1 000個/mL,搖勻計時。

氨海水單獨處理時,處理濃度梯度設(shè)定為: 0.0025%、0.005%、0.01%、0.015%、0.020%和0.025%(以分析純氨水25%～26%為100%)。處理時間梯度為:15、30、45和60 min。

5-羥色胺單獨處理時,處理濃度梯度設(shè)定為: 0.001、0.002、0.003和0.004 mol/L。處理時間梯度為:15、30、45和60 min。

聯(lián)合處理時,選取前面2組中較好的濃度加以混合,并根據(jù)情況特別添加了先用氨海水浸泡再用5-羥色胺浸泡的處理組(T組)。處理時間同上。

選用在正常海水中浸泡的卵母細胞作為對照,每次實驗設(shè)3個平行組。

1.3 人工授精

取出處理完畢的卵液,用500目篩絹過濾,洗去處理液,加入5 mL小瓶中,再滴入1～2滴活力旺盛的精子,搖勻。受精過程中盡量多晃動。

1.4 觀察記錄GVBD發(fā)生率、受精率

受精2～3 h后,取樣進行顯微拍照,照片用于計算GVBD發(fā)生率、受精率。

GVBD發(fā)生率=發(fā)生GVBD的細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%;

受精率=正常卵裂的細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%;

相對GVBD發(fā)生率=處理組GVBD發(fā)生率-海水組GVBD發(fā)生率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

最后的數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行雙因子方差分析,以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 卵母細胞一系列形態(tài)變化

通過解剖獲得的櫛孔扇貝卵母細胞經(jīng)過海水浸泡,生發(fā)泡依然未破裂(見圖1A),有時也有例外(見2.3);處理后櫛孔扇貝卵母細胞發(fā)生GVBD(見圖1B);體外促熟的卵母細胞受精后,部分可以正常發(fā)育(見圖1C);部分卵子促熟效果不明顯,呈現(xiàn)不受精、發(fā)育過慢、發(fā)育畸形等情況(見圖1D)。

圖1 櫛孔扇貝剝離卵的形態(tài)變化Fig.1 Morphology changes of oocyte stripped from scallop,Chlamys f arrer

2.2 氨海水對卵母細胞的促熟作用

氨海水可以顯著地促使櫛孔扇貝卵母細胞生發(fā)泡破裂(見圖2),除氨0.0025%組之外,其它濃度都達到了100%的GVBD發(fā)生率,海水對照組僅為6%,差異極顯著(P<0.01)。

卵母細胞經(jīng)過氨海水處理后受精,如圖3,除個別組與海水對照差異不顯著外,都能極顯著的提高受精率(P<0.01)。氨0.002 5%處理組體現(xiàn)出一定的時間依賴關(guān)系,隨著時間從15 min增加到45 min受精率呈增長趨勢,差異極顯著(P<0.01),其它濃度處理沒有時間依賴關(guān)系(P>0.05);相同的時間處理下,表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系,15和30 min時,氨0.005%與0.01%處理組受精率都高于其它組,差異極顯著(P< 0.01),45和60 min時,氨0.005%處理組受精率高于其它組,差異顯著(P<0.05)。

氨海水最佳處理條件基本確定為:氨0.005%濃度,在處理時間15、30、45和60 min時受精率分別達到了(13.28±2.14)%、(15.88±2.15)%、(15.34± 1.41)%、(12.23±1.69)%,氨0.01%組在短時間處理時也不錯,在15和30 min時受精卵分別達到了(13.82 ±2.65)%和(12.55±2.44)%。

圖2 氨海水處理對GVBD發(fā)生率的影響Fig.2 GVBD rate of AS treatment

圖3 氨海水處理對受精率的影響Fig.3 Fertilizing rate of AS treatment

2.3 5-HT對卵母細胞的促熟作用

櫛孔扇貝解剖出的卵母細胞在海水中浸泡一段時間也有部分生發(fā)泡破裂,不同濃度和時間的5-羥色胺處理后,生發(fā)泡破裂率沒有明顯的提高,與海水對照組差異不顯著(P>0.05)(見圖4)。但經(jīng)5-HT處理后,除0.004 mol/L組外,受精率都明顯高于對照組(見圖5),差異極顯著(P<0.01)。0.002 mol/L處理組表現(xiàn)出一定的時間依賴性,受精率隨著處理實踐的延長而增高,處理45 min時受精率達到最大(24.74± 1.33)%;處理時間增加至60 min時,受精率有所降低,但差異不顯著(P>0.05)。其它濃度處理組沒有表現(xiàn)出明顯的時間依賴性。相同時間處理下,表現(xiàn)出較強的濃度依賴性,除15 min外,其它處理時間下, 0.002 mol/L組受精率都明顯高于其它組,差異極顯著(P<0.01)。

圖4 5-HT對GVBD發(fā)生率的影響Fig.4 GVBD rate of 5-HT treatment

圖5 5-HT對受精率的影響Fig.5 Fertilizing rate of 5-HT treatment

2.4 氨海水與5-HT聯(lián)合促熟作用

使用氨海水最適濃度0.005%與不同濃度5-羥色胺混合處理時,受精率極低,只有一部分生發(fā)泡破裂。如圖6所示,最高的相對GVBD發(fā)生率只有(8.48± 0.11)%,低于氨海水單獨作用,說明氨水的作用受到5-羥色胺的抑制。

適當(dāng)提高氨海水濃度,與5-羥色胺混合處理, GVBD發(fā)生率達到100%?？紤]到2種試劑間的相互干擾,特別添加了T組,即先后用最適條件的氨海水和5-羥色胺處理。

在混合處理中,氨0.010%與5-HT 0.001 mol/L混合取得最好效果,處理時間在15～30 min間受精率變化不明顯,為(24.09±1.13)%～(25.57±0.46)%之間,高于氨海水單獨處理。

圖6 聯(lián)合處理相互抑制下的相對GVBD發(fā)生率Fig.6 Comparatively GVBD rate of mix treatment

如圖7所示,除c組與d組濃度下45與60 min處理外,其它各組受精率都顯著高于對照組(P<0.01)。時間依賴性上,T組在45 min受精率高于其它時間處理,差異顯著(P<0.05),其它濃度沒有時間依賴性;相同時間處理時,在15 min、30 min時T組與200+1組差異不顯著(P>0.05),但高于其它濃度組(P< 0.01),在45 min時,T組受精率高于其它濃度組(P< 0.01)。

圖7 聯(lián)合處理受精率Fig.7 Fertilizing rate of mix treatment

而用最適濃度的氨海水和5-羥色胺相繼處理的T組在處理45 min時表現(xiàn)出了整個實驗最好的誘導(dǎo)效果,受精率達到(40.02±2.73)%,明顯高于混合處理和單獨處理(P<0.001)。

3 討論

3.1 解剖卵體外促熟的可行性

雙殼貝類精子入卵的時機有2種,1種是初級卵母細胞處于第一次減數(shù)分裂之前,如卵生型牡蠣、中國蛤蜊;另一種是初級卵母細胞生發(fā)泡已經(jīng)消失,初級卵母細胞處于第1次減數(shù)分裂中期[1],如扇貝、菲律賓蛤仔。

對于第1種類型的貝類,解剖獲得卵母細胞可以直接用于受精,但是,適當(dāng)?shù)捏w外促熟可以提高卵母細胞的同步性,提高受精率[1]。王昭萍等以太平洋牡蠣的剝離卵子為材料進行體外促熟,采用海水浸泡及維生素處理等方法促進成熟較差的卵子進一步成熟,獲得了成功[2];任素蓮等利用海水、氨海水中浸泡使太平洋牡蠣的剝離卵生成泡破裂,促進卵子的繼續(xù)發(fā)育,卵子在氨海水中的發(fā)育速度要快于在純海水中的發(fā)育速度[8];沈亦平等利用氨水和海水對解剖獲取的馬氏珠母貝卵子的促熟過程進行了比較研究[3]。

對于第2種貝類,由于解剖獲得的卵母細胞處于前期,直接受精無法完成,所以多采用陰干等方法進行催產(chǎn),體外促熟的研究比較少,氨海水體外促熟的方法在縊蟶、旗江珧[9]等貝類中有所應(yīng)用,但是效果一般; Gloria等利用組胺對紫扇貝卵子進行體外促熟,避免了雌雄同體的自交[4]。

櫛孔扇貝也屬于第2種類型的貝類,目前還未見關(guān)于其解剖取卵及體外促熟的報道。本研究采用氨海水和5-羥色胺(5-HT)對櫛孔扇貝的解剖卵進行處理,發(fā)現(xiàn)氨海水能有效地促使卵母細胞生發(fā)泡破裂, GVBD發(fā)生率可高達100%;5-羥色胺對生發(fā)泡破裂無明顯作用,但可以顯著的提高生發(fā)泡已經(jīng)破裂的卵母細胞的受精率,氨海水與5-羥色胺的聯(lián)合處理使得櫛孔扇貝解剖卵受精率達40%,這為進一步的試驗及應(yīng)用提供了良好基礎(chǔ)。

3.2 生發(fā)泡破裂與卵母細胞成熟的關(guān)系

卵母細胞的成熟過程對動物卵子的受精以及以后的發(fā)育過程是至關(guān)重要的[10]。解剖獲得的櫛孔扇貝的卵母細胞處于前期I阻滯狀態(tài),經(jīng)過激活,會在第1次減數(shù)分裂的中期發(fā)生第2次阻滯,之后通過受精作用的激活完成整個減數(shù)分裂過程,并進一步發(fā)育。

在已有的研究中,生發(fā)泡破裂(GVBD)通常被認為是卵母細胞成熟的標(biāo)志[11],意味著卵母細胞啟動了減數(shù)分裂。然而本研究發(fā)現(xiàn),生發(fā)泡破裂并不意味著卵母細胞的真正成熟。經(jīng)解剖獲得的櫛孔扇貝卵母細胞有時會有部分生發(fā)泡已經(jīng)破裂,但是這部分卵母細胞無法完成受精和分裂。同樣,用一定濃度的氨海水(0.005%～0.025%)處理櫛孔扇貝卵母細胞,可以顯著的促使生發(fā)泡破裂,GVBD發(fā)生率達到100%,但是受精率依然不高,表明生發(fā)泡破裂之后只有少量卵母細胞能進一步完成成熟過程。

生發(fā)泡破裂可能只是是重新啟動減數(shù)分裂的第一步,由生發(fā)泡破裂到第1次減數(shù)分裂中期這一過程卻不一定能實現(xiàn),依然需要激活。5-HT可以顯著的提高生發(fā)泡已經(jīng)破裂的卵母細胞的受精率,表明5-HT正是起到了這種激活作用。

由此可以看出,對櫛孔扇貝來說,生發(fā)泡破裂是卵母細胞成熟的必要條件,而非充分條件,生發(fā)泡破裂之后需要進一步的激活才能使卵母細胞進入到成熟過程。

3.3 氨海水和5-HT的互補性及作用機理

本研究表明,氨海水能有效地促使卵母細胞生發(fā)泡破裂,而5-羥色胺可以顯著的提高生發(fā)泡已經(jīng)破裂的卵母細胞的受精率,充分表明氨海水和5-HT對扇貝解剖卵的促熟作用具有一定的互補性。

Loosanoff提出在海水中加入氨海水溶液,可促使雙殼類(如Tapes Sedidecussata)卵母細胞生發(fā)泡的破裂,有利于卵的受精[12]。方永強進一步肯定了氨海水是菲律賓蛤卵母細胞達到生理成熟的必要因子,并提出氨海水是通過激發(fā)核與細胞器的物質(zhì)和能量代謝來實現(xiàn)激活作用的[13]。在本研究中,氨海水在一定濃度下可以顯著的促使櫛孔扇貝卵母細胞生發(fā)泡破裂(見圖2),但是這種初步的作用并沒有得到可觀的受精率,最高只有15%左右(見圖3),可能是因為氨海水的促熟作用比較初步,無法對卵母細胞的重要調(diào)控因子(如成熟促進因子MPF、有絲分裂原激活的蛋白激酶MAPK、環(huán)磷酸腺苷cAMP等[14-16])起到關(guān)鍵的作用。

5-HT作為1種信號分子,可以與卵母細胞膜表面的G蛋白(GTP結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白)偶聯(lián)受體結(jié)合,導(dǎo)致細胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使,從而將胞外信號跨膜傳遞到胞內(nèi)影響細胞的行為。G蛋白偶聯(lián)受體所介導(dǎo)的細胞信號通路主要包括cAMP信號通路和磷脂酰肌醇信號通路。目前的研究發(fā)現(xiàn),這2條通路都參與了雙殼貝類卵母細胞的成熟過程[6,17-18]。王清等研究了cAMP信號通路在5-HT誘導(dǎo)硬殼蛤卵母細胞成熟過程中的作用[5]。本研究中,5-HT在所用的濃度范圍內(nèi)對櫛孔扇貝卵母細胞的生發(fā)泡破裂沒有作用(見圖4),但是對已經(jīng)發(fā)生生發(fā)泡破裂的卵母細胞可以進一步的激活,受精率雖然最高也只有25%左右(見圖5),但是相對于只有37%的GVBD發(fā)生率,激活效率很高。大多數(shù)情況下,解剖出的卵母細胞生發(fā)泡破裂率很低,所以單獨使用5-HT處理沒有明顯的促熟效果,這表明5-HT對櫛孔扇貝卵母細胞信號通路的調(diào)控作用可能主要體現(xiàn)在生發(fā)泡破裂后到第一次減數(shù)分裂中期這個階段。

氨海水和5-HT的混合處理情況較復(fù)雜,當(dāng)使用氨海水濃度較低時,5-HT顯著的抑制了氨海水的作用(見圖6),提高氨海水濃度的混合處理,受精率比單獨處理有所提高(25%),依然不夠理想。先用氨海水處理再用5-HT處理,排除了2種試劑的相互干擾,達到了較好效果,受精率最高達到40%以上,但這與生產(chǎn)應(yīng)用還有較大的距離。有關(guān)氨海水和5-HT對扇貝解剖卵的促熟條件優(yōu)化和作用機理尚有待于進一步的研究。

[1] 王如才,王昭萍,張建中.海水貝類養(yǎng)殖學(xué)[M].1版.青島:青島海洋大學(xué)出版社,1998.

[2] 王昭萍,王如才,李洪剛,等.維生素及海水浸泡隊牡蠣卵子的體外促熟作用[J].海洋湖沼通報,1997(2):70-75.

[3] 沈亦平,姜海波,劉汀,等.合浦珠母貝卵子成熟的細胞學(xué)觀察[J].武漢大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,1993(5):109-114.

[4] Gloria M,Livia M,Miguel AP,et al.A method to eliminate selffertilization in a simultaneous hermaphrodite scallop.1.Effects on growth and survival of larvae and juveniles[J].Aquaculture, 2007,273:459-469.

[5] 王清,張濤,張立斌.cAMP信號通路在5-羥色胺誘導(dǎo)硬殼蛤卵母細胞成熟過程中的作用[J].高技術(shù)通訊,2008,18(1):91-96.

[6] Eckberg W R.Intracellular signal transduction and amplification mechanisms in the regulation of oocyte maturation[J].Biol Bull, 1988,174:95-108.

[7] Allen R D.Fertilization and artificial activation in the egg of the surf clamS pisulasolidissima[J].Biol Bull,1953,105:213-239.

[8] 任素蓮,繩秀珍,王如才,等.太平洋牡蠣卵子體外發(fā)育的研究[J].海洋科學(xué),2001,25(7):35-38.

[9] 余祥勇,王梅芳,何志江,等.旗江珧早期胚胎發(fā)育的初步研究[J].海洋科學(xué),1999(4):62-65.

[10] Masui Y,Clarke H J.Oocyte maturation[J].Int Rev Cytol, 1979,57:185-282.

[11] Eppig J J.The relationship between cumulus cell-oocyte coupling,oocyte meiotic maturation,and cumulus expansion[J]. Dev Biol,1982,89:268-272.

[12] Loosanoff V,H C Davis.Advances in marine biology[M].London and New York:Academic press,1963(1):15-17.

[13] 方永強.菲律賓蛤生殖機制的研究Ⅱ.氨海水促使卵母細胞成熟的超微結(jié)構(gòu)研究[J].臺灣海峽,1982,1(2):99-105.

[14] Goudet G,Belin F,Bezard J,et al.Maturation-promoting factor (MPF)and mitogen activated protein kinases(MAPK)expression in relation to oocyte competence for in-vitro maturation in the male[J].Mol Hum Reprod,1998,4(6):563-570.

[15] Ye J,Flint A P,Luck M R,et al.Independent activation of MAP kinase and MPF during the initiation of meiotic maturation in pig oocytes[J].Reproduction,2003,125(5):645-656.

[16] Downs S M,Hudson E R,Hardie D G.A potential role for AMP-activated protein kinase in meiotic induction in mouse oocytes [J].Dev Biol,2002,245(1):200-212.

[17] Guerrier P,Leclerc-David C,Moreau M.Evidence for the involvement of internal calcium stores during serotonin-induced meiosis reinitiation in oocytes of bivalve mollusc Ruditapes phillippinarum[J].Dev Biol,1993,159:474-484.

[18] Bloom T L,Szuts E Z,Eckberg W R.Inositol trisphosphate,inositol phospholipid metabolism,and germinal vesicle breakdown in surf clam oocytes[J].Dev Biol,1988,129:532-540.

Abstract: To test the effect of ammonia seawater and 5-HT on the maturation of oocyte stripped from scallop,Chlamys f arreri(Jones et Preston),Oocytes were treated with ammonia seawater and 5-HT in vitro,and then fertilized artificially.Results showed that ammonia seawater can induce Germinal Vesicle Breakdown(GVBD)of scallop oocytes remarkably,but the fertilizing rate was low.5-HT can not induce GVBD of oocytes,but can induce the maturation of the oocytes already GVBD.Oocytes first induced by ammonia seawater then induced by 5-HT showed the best effects,and the fertilizing rate was(40.02± 2.73)%.

Key words: Chlamys f arrer(Jones et Preston);maturation improvement;ammonia seawater;5-HT

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Effect of Ammonia Seawater and 5-HT on Maturation of Oocyte Stripped from Scallop,Chlamys farreri(Jones et Preston)

DI Wei-Peng,WANG Zhao-Ping,YU Rui-Hai,ZHOU Shan-Shan,GU Ling-Ling,LI Ning
(The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

S961.2+2

A

1672-5174(2011)04-046-05

國家自然科學(xué)基金項目(30771622);國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2006AA10A401)資助

2010-01-22;

2010-03-23

邸煒鵬(1984-),男,碩士生,主要從事貝類遺傳育種研究。E-mail:diweipeng05110@163.com

E-mail:zpwang@ouc.edu.cn