魏 捷，蔣 華

器官培養(yǎng)保存法是目前國際上主要的角膜供體長期保存法，能保持角膜內皮細胞（corneal endothelial cells，CEC）活性長達 4周，不僅利于合理配置角膜資源，而且角膜抗原性也會隨保存時間延長而逐漸減弱。研究認為，保存至3周時角膜片內的樹突狀細胞可完全消失[1]，可以降低免疫排斥反應發(fā)生率。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）因為營養(yǎng)成分豐富在器官培養(yǎng)保存法中應用廣泛，但其批間變異大，成分不夠清晰穩(wěn)定，還有病原體污染風險。出于對人體安全性的長遠考慮，有必要考慮自培養(yǎng)基中去除血清成分[2]。本實驗擬對新型培養(yǎng)基－無動物成分培養(yǎng)基 （animal compound free medium，ACF）在無血清器官培養(yǎng)保存CEC活性方面的效果進行初步探索。

1 材料和方法

1.1 材料與動物分組 16只SPF級成年Wistar大鼠，體重200～250 g，雌雄不限，山東大學動物實驗中心提供，過量麻醉處死，取雙側眼球。ACF購自美國Sciencell公司，MEM購自美國Gibco公司，葡聚糖T-500購自美國Pharmacia公司，兔多克隆抗ZO-1抗體購自Santa Cruz公司，SP-9000免疫組化染色試劑盒來自北京中杉金橋生物技術有限公司，RNA裂解液、總RNA提取試劑盒購自上海華美生物工程公司，TaKaRa試劑盒及DNA Marker由大連寶生物公司提供，引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。將角膜片隨機分為2組，每組16只。對照組：角膜保存于MEM+2%FBS培養(yǎng)液中。試驗組：即ACF組，角膜保存于無血清的ACF培養(yǎng)液中。

1.2 角膜器官培養(yǎng)保存方法 在超凈臺上按眼庫標準無菌化程序處理。生理鹽水沖洗眼球，再依序浸泡于0.5%碘伏溶液和含500 U/ml慶大霉素的乳酸林格液中，時間分別為2、20 min。剪下完整角膜片，角鞏膜緣縫合1針后懸吊于20 ml培養(yǎng)液中，密封保存瓶口，置于31℃恒溫箱中不換液保存4周。保存結束后，將角膜移至10 ml脫水液（各組培養(yǎng)液中加5%葡聚糖T500）中，31℃恒溫脫水48 h。

1.3 保存前后ECD計數(shù) 保存前大鼠角膜置于培養(yǎng)皿中，0.9%生理鹽水浸泡4 min，使細胞間隙暫時擴大，倒置顯微鏡下計數(shù)角膜內皮細胞密度（endothelial cells density，ECD）。 保存結束脫水后，大鼠角膜內皮面滴0.25%臺盼藍染色1 min，生理鹽水緩慢漂洗，再滴1%茜素紅染色2 min，生理鹽水漂洗，普通光學顯微鏡下計數(shù)角膜ECD。

1.4 免疫組織化學染色法檢測內皮層中ZO-1的表達 保存結束取出大鼠角膜，立即OCT包埋，液氮內速凍15 min，轉入深低溫冰箱保存?zhèn)溆?。檢測時連續(xù)冰凍切片，厚度4 μm，常規(guī)貼片、固定，晾干，密封，4℃短期保存。染色當天取出玻片，按說明書行SP三步法免疫組織化學染色，風干，封片，觀察照相。兔多克隆抗ZO-1抗體按1∶200濃度稀釋。

1.5 RT-PCR檢測去上皮角膜中ZO-1mRNA表達每組取6只保存后大鼠角膜，去除上皮層，按照TRIzol試劑盒說明書進行總RNA的提取，逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。ZO-1(249bP)的上游引物：5’-GCCTCTGCAGTTAAGCAT-3’，下游引物：5’-AAGAGCTGGCTGTTTTAA-3’。 β-actin(281bP)的上游引物：5'-TGACGAGGCCCAGAGCAAGA-3'，下游引物：5'-ATGGGCACAGTGTGGGTGAC-3'。 PCR擴增條件：94℃預變性5 min，反應35個循環(huán)，其中94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循環(huán)結束后72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳100 min，凝膠紫外成像系統(tǒng)中掃描拍照并分析，

以目的基因的擴增帶灰度與同管擴增的β-actin擴增帶灰度之比來表示目的基因的mRNA表達水平。1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)先求出組內x±s，顯著性分析用t檢驗。

表1 保存前后各組大鼠角膜內皮細胞密度（個/mm2，x±s)

2 結果

2.1 培養(yǎng)保存過程中角膜的大體圖像 自培養(yǎng)后第2天，兩組角膜出現(xiàn)漸進性加重的基質水腫，上皮灰白色混濁，中央出現(xiàn)片狀剝離。此后，角膜水腫逐漸加重，基質明顯增厚，內皮面出現(xiàn)皺褶并逐漸增多。多數(shù)角膜在保存7～10 d時厚度達峰值。在葡聚糖T500中脫水48 h后，角膜變薄并基本恢復透明。

2.2 保存前后CEC計數(shù) 保存前兩組間角膜ECD無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。保存結束并脫水2 d后，對照組ECD大幅下降，而ACF組的ECD則高于2000個/mm2，組間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。計算 28 d保存期內日均CEC丟失率 [(保存前ECD－保存后ECD)／保存前ECD×100%÷28]衡量CEC損失程度，發(fā)現(xiàn)ACF組明顯低于對照組，兩組間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。脫水結束后，活性染色顯示ACF組中CEC死亡比例明顯低于對照組，組間比較差異非常顯著（P＜0.01）。 見表 1。

2.3 免疫組織化學染色結果 冰凍切片顯示ZO-1在大鼠角膜內皮面有明確表達，呈棕黃色顆粒，廣泛分布于胞漿內（圖1）。ACF組切片上CEC與后彈力層貼附較緊密，ZO-1即隨內皮細胞呈連續(xù)線形表達，表達強度高；對照組CEC間連接相對松散，有部分細胞脫落或不表達，ZO-1表達強度相對降低。

①對照（MEM+20 ml/L FBS)組 ②ACF 組圖 1 保存后大鼠角膜內皮層中ZO-1的表達（SABC ×400）

2.4 RT-PCR半定量檢測去上皮大鼠角膜中ZO-1mRNA的表達 結果顯示兩組大鼠角膜都有ZO-1mRNA表達，大小249 bp，與目的基因長度一致（圖 2）。ACF組 ZO-1mRNA表達水平 （0.921 8±0.027 0）明顯高于對照組（0.452 7±0.012 7），組間比較有非常顯著性差異（t=38.448，P=0.000）。

圖 2 RT-PCR檢測去上皮大鼠角膜中ZO-1mRNA表達的電泳圖

3 討論

要實現(xiàn)角膜植片無血清器官培養(yǎng)方式，前提是尋找到營養(yǎng)成分更為豐富的替代培養(yǎng)基。近年來，一些特殊設計無血清培養(yǎng)基相繼問世，而被稱作“chemical defined”（CD，限定化學成分的）的無動物來源培養(yǎng)基的出現(xiàn)，標志著細胞培養(yǎng)基發(fā)展的更高境界，徹底消除了培養(yǎng)基生物安全方面的擔憂。目前國外學者在該領域的研究結論多傾向于選擇endothelial SFM[3，4]，一種原設計支持人臍靜脈和臍動脈內皮細胞分離、生長的特殊培養(yǎng)基。它對CEC的保存效果確切，但價格昂貴，不是推廣應用的最佳選擇。因此，本實驗選擇研究成本相對較低的ACF。

Slettedal等[4]研究證實，即使在人角膜，在器官保存損傷過程中，CEC也會啟動修復程序，具體修復機制不僅有擴大移行，還包括增殖分裂過程。而ACF中富含多種對于啟動和促進CEC的增殖修復都非常關鍵的生長因子和種類豐富的其他營養(yǎng)成分，可以更好地發(fā)揮內皮保護作用[5]。本實驗結果顯示，保存結束后，MEM＋2%FBS組的ECD值降至2000個/mm2以下，證明這種“基礎”培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不足以充分滿足不換液狀態(tài)下CEC的長期生存需要。相比之下，無血清的ACF組不僅最終ECD值要高出許多，達到（2 143±169）個/mm2，還同時擁有較低的細胞日均損失率和死亡細胞比例。在眼庫工作中，角膜ECD值是評價保存后植片質量的最重要指標，多要求在2 000～2 200個/mm2以上，ACF組的保存結果完全滿足該項要求，進一步證明無血清ACF可以較傳統(tǒng)MEM培養(yǎng)基更好地保存CEC活性，滿足移植手術的需要。

細胞間緊密連接在維持內皮細胞屏障功能上發(fā)揮著重要作用[6]。ZO-1是一種磷酸蛋白，蛋白家族膜相關鳥苷酸激酶的家族成員，分子量220 000，屬結構性跨膜蛋白，是構成上皮和內皮細胞間緊密連接的重要成分之一，到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)缺乏ZO-1的緊密連接。若是ZO-1表達水平下降或缺失，多數(shù)情況下存在緊密連接的組織結構如血腦屏障、視網(wǎng)膜色素上皮細胞間、角膜內皮細胞間等會隨之松散甚至分解，所以ZO-1常被用作緊密連接的屏障功能和通透性功能的衡量指標[7，8]?，F(xiàn)有ZO-1抗體只可用于人或鼠，因此，筆者選用大鼠角膜來做檢測。病理切片發(fā)現(xiàn)ZO-1的確存在于保存后大鼠CEC層。不過大鼠角膜小且后彈力層菲薄撕除難度大，而ZO-1在基質中又少有表達，所以半定量RT-PCR法改為檢測去上皮后大鼠角膜中ZO-1的表達，結果與CEC的計數(shù)資料趨勢保持一致，ZO-1在ACF保存組的表達水平明顯高于MEM組，檢測ZO-1的表達可在一定程度上輔助反映CEC的功能狀態(tài)和細胞間緊密連接的完整性，也從另一個側面證實了ACF能有效保持CEC活性的良好效果。

綜上所述，自器官培養(yǎng)基中除去血清成分是組織細胞培養(yǎng)發(fā)展過程中的新要求和必然趨勢。ACF營養(yǎng)豐富，能有效降低密閉保存過程中CEC的損失程度，成分明確，便于進行對比研究，還可以排除病原體傳染風險，對CEC的保護作用明顯超越傳統(tǒng)的MEM，在無血清器官培養(yǎng)保存CEC活性方面極有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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