古少鵬，王敏霞，趙素芬，鄭明學(xué)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

雞盲腸上皮細(xì)胞是雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)（E．tenella）的宿主細(xì)胞，研究盲腸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，為E．tenella入侵宿主細(xì)胞提供體外模型，對(duì)研究E．tenella損傷機(jī)制及抗球蟲(chóng)藥有著重要的意義。獲得高純度的上皮細(xì)胞是用其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的前提和基礎(chǔ)，但用消化酶消化法分離盲腸上皮細(xì)胞時(shí)必然混有大量的成纖維細(xì)胞等非目的細(xì)胞，且容易“瘋長(zhǎng)”成優(yōu)勢(shì)細(xì)胞群，造成上皮細(xì)胞純度過(guò)低，無(wú)法進(jìn)行試驗(yàn)研究。因此，選擇適宜的消化酶和消化條件可獲得大量健全的絨毛隱窩單位［1］，有助于上皮細(xì)胞的純化。此外，適宜的生長(zhǎng)環(huán)境和種植密度也有利于獲得高純度上皮細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，培養(yǎng)中應(yīng)進(jìn)一步選擇適宜的方法純化［2］，方能滿足研究需要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)腸上皮細(xì)胞（IEC）進(jìn)行了培養(yǎng)和純化，來(lái)源涉及鼠、人、雞、兔等物種［1，3～5］，而雞胚盲腸上 皮細(xì)胞培養(yǎng) 尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，我們?cè)谇捌谶x擇的最佳消化條件和培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，探究適宜的雞胚盲腸上皮細(xì)胞純化方法，以期為雞盲腸上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

15～18日齡SPF雞胚，購(gòu)自山西隆克爾生物制藥有限公司。

1．1．2 主要試劑

嗜熱菌蛋白酶（美國(guó)Sigma），粉末低糖型DMEM、液體低糖型DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO，美國(guó)）；羥乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、L－谷氨酰胺、丙酮酸鈉、甘梨醇、肝素鈉、臺(tái)盼藍(lán)均為Amresco公司產(chǎn)品；堅(jiān)固藍(lán)BB鹽為Sigma公司產(chǎn)品；優(yōu)級(jí)胎牛血清進(jìn)口分裝；青霉素及硫酸鏈霉素為華北制藥股份有限公司；其余藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．2 方法

1．2．1 雞胚盲腸上皮細(xì)胞的消化

18日齡的雞胚無(wú)菌取出盲腸，除腸系膜，縱切開(kāi)盲腸，置于小燒杯中，用加有雙抗的組織分散液（pH 7．4，2%甘梨醇和5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基）沖洗到上清基本清亮，剪碎成小于1mm3的組織塊，再用組織分散液洗，沉淀1min，去除上清液，重復(fù)該步驟至上清液清亮；將剪碎的盲腸組織轉(zhuǎn)移到青霉素小瓶中，加入50mg·L－1的嗜熱菌蛋白酶的HEPES消化液，37℃慢速振蕩消化120 min，消化完后用吸管吹打5min，靜置除去上清液，向沉淀中加少量組織分散液吹打混勻靜置取上清，重復(fù)此過(guò)程3次，最后得到的上清1600r·min－1離心3min，收集沉淀細(xì)胞，制成細(xì)胞混懸液。用移液槍取收集到的細(xì)胞混懸液和0．4%臺(tái)盼藍(lán)染液按1∶1于載玻片上混勻，加蓋玻片，1～2 min后于顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，于不同的視野計(jì)數(shù)3次?；罴?xì)胞圓形透亮不著色，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色。細(xì)胞活力計(jì)算公式如下：活細(xì)胞率＝活細(xì)胞總數(shù)／（活細(xì)胞總數(shù)＋死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1．2．2 雞胚盲腸上皮細(xì)胞的純化

（1）低速離心去除單細(xì)胞

將1．2．1制成的細(xì)胞懸液經(jīng)400μm不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾后分不同的轉(zhuǎn)速和時(shí)間離心，分別是：1000r·min－1離心3min、1000r·min－1離心5 min、1200r·min－1離心5min和1400r·min－1離心5min。離心后取一滴上清于顯微鏡下觀察，以上清中單細(xì)胞多且無(wú)團(tuán)塊的轉(zhuǎn)速和時(shí)間為最佳離心條件。

上清中單細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)單細(xì)胞為－；3個(gè)視野中平均單細(xì)胞＜5個(gè)為＋；3個(gè)視野中平均單細(xì)胞為5～10個(gè)為＋＋；3個(gè)視野中平均單細(xì)胞為10～15個(gè)為＋＋＋；3個(gè)視野中平均單細(xì)胞為15個(gè)以上為＋＋＋＋。

上清中團(tuán)塊判定標(biāo)準(zhǔn)如下：3個(gè)視野中無(wú)團(tuán)塊為－；3個(gè)視野中平均團(tuán)塊數(shù)＜1個(gè)為＋；3個(gè)視野中平均團(tuán)塊數(shù)為1～2個(gè)為＋＋；3個(gè)視野中平均團(tuán)塊數(shù)為2～3個(gè)為＋＋＋；3個(gè)視野中平均團(tuán)塊數(shù)為3個(gè)以上為＋＋＋＋

（2）差速貼壁去除成纖維細(xì)胞

將1．2．1制成的細(xì)胞懸液于玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)1．5h再倒瓶培養(yǎng)，分別于倒瓶之前和之后取培養(yǎng)液進(jìn)行涂片，布安氏液固定，H．E．染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)單細(xì)胞和團(tuán)塊所占的比例。

（3）低速離心結(jié)合差速貼壁純化上皮細(xì)胞

將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液以1200r·min－1離心5 min沉淀細(xì)胞，最后收集的細(xì)胞先用含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液（pH7．3低糖型DMEM10g·L－1＋20μg·L－1表皮生長(zhǎng)因子＋0．1g·L－1肝素鈉＋110mg·L－1丙酮酸鈉＋2．5mg·L－1胰島素＋200mmol·L－1谷氨酰胺＋100U·mL－1青霉素＋100mg·L－1鏈霉素）懸浮，種植到玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，1．5h后把培養(yǎng)液連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中1500r·min－1離心5min，細(xì)胞沉淀重新加入含2．5%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為每毫升2×105個(gè)團(tuán)塊。將蓋玻片切割成適當(dāng)大小，放入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種IEC細(xì)胞懸液，每孔400μL，培養(yǎng)于38．5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，取培養(yǎng)至第3、4、6、7、8、11天的爬片細(xì)胞，甲醛甲醇固定，堿性磷酸酶染色孵育液染色（1－萘酚－磷酸鈉50mg，0．2mol·L－1的pH 9．0Tris－HCl緩沖液60mL，蒸餾水60 mL，堅(jiān)固藍(lán)BB鹽80mg充分混合，過(guò)濾），蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，光鏡觀察。陽(yáng)性細(xì)胞胞漿被染成棕黑色～棕黃色；陰性細(xì)胞不著色。每張片觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算上皮細(xì)胞所占比例。

1．2．3 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 12．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果中數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2．1 消化后的細(xì)胞活力

嗜熱菌蛋白酶消化后細(xì)胞活力為（97．33±0．21）%。這與嗜熱菌蛋白酶作用于腸黏膜基底膜特定分子，對(duì)細(xì)胞損傷小有關(guān)，故培養(yǎng)出的腸上皮細(xì)胞具有活力強(qiáng)的特點(diǎn)。

2．2 低速離心去除單細(xì)胞

通過(guò)離心后檢測(cè)上清發(fā)現(xiàn)1200r·min－1離心5min時(shí)上清中單細(xì)胞較多且?guī)缀鯚o(wú)團(tuán)塊，為分離雞胚盲腸上皮細(xì)胞的最佳離心條件。各離心條件離心雞胚盲腸上皮細(xì)胞結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 離心法去除單細(xì)胞效果Table 1 Effects of eliminating single cells by centrifuging

2．3 差速貼壁去除成纖維細(xì)胞

貼壁1．5h倒瓶后團(tuán)塊比例（27．83±1．89）%大于貼壁前（22．23±1．62）%。由于成纖維細(xì)胞具有貼壁快的特點(diǎn)，1．5h基本全部貼壁，而IEC貼壁需12～24h或更長(zhǎng)時(shí)間，這樣倒瓶后的細(xì)胞就為比較純的IEC。

2．4 低速離心結(jié)合差速貼壁純化上皮細(xì)胞后的觀察

2．4．1 形態(tài)學(xué)檢查

圖1 雞胚盲腸上皮細(xì)胞呈鋪路石樣生長(zhǎng)×400Fig．1 Cobblestone－like cecum epithelial cells from chicken embryo×400

種植24h部分細(xì)胞貼壁，多呈圓形，部分細(xì)胞已伸展呈梭形和鋪路石樣；48h大部分細(xì)胞已貼壁并開(kāi)始伸展，梭形和鋪路石樣的細(xì)胞均明顯多于24h。細(xì)胞培養(yǎng)至第3天可見(jiàn)到未分散開(kāi)的組織塊，在組織塊周?chē)杏坞x的上皮樣細(xì)胞及顆粒狀物質(zhì)，它們包圍在組織塊周?chē)?，呈暈狀。以后?xì)胞暈仍存在并變大，上皮樣細(xì)胞排列緊密，成片生長(zhǎng)，梭形的成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)于細(xì)胞暈外圍。有時(shí)可見(jiàn)鋪路石樣細(xì)胞排列緊密相互連接被一層膜包裹，形成上皮膜，以后生長(zhǎng)時(shí)上皮膜整體移動(dòng)，整個(gè)變大，鋪路石樣細(xì)胞逐漸呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，一直持續(xù)到第14天以上，見(jiàn)圖1。

2．4．2 堿性磷酸酶染色

鋪路石樣細(xì)胞和散在的上皮細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性（圖2）。所分離的細(xì)胞培養(yǎng)至第3、4、6、7、8、11天時(shí)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞比例均大于72%，見(jiàn)表2。提示本法培養(yǎng)的雞胚盲腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)周期為11d以上，且純度較高。

圖2 鋪路石樣的上皮細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性×400Fig．2 Cobblestone－like epithelial cells are positive by AKP staining×400

表2 堿性磷酸酶染色陽(yáng)性細(xì)胞比例Table 2 Percentage of positive epithelial cells by AKP staining

3 討論與結(jié)論

常用的純化上皮細(xì)胞的方法有機(jī)械刮除法、差速貼壁純化法及消化排除法等。差速貼壁純化上皮細(xì)胞的方法是根據(jù)成纖維細(xì)胞貼壁快的特點(diǎn)，90 min基本全部貼壁，而IEC貼壁需12～24h或更長(zhǎng)時(shí)間，這樣倒瓶后的細(xì)胞就是比較純的IEC，其操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞影響小。張道杰等用嗜熱菌蛋白酶進(jìn)行人腸上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)，采用差速貼壁純化法獲得的腸上皮細(xì)胞經(jīng)免疫組化證實(shí)上皮細(xì)胞膜抗原陽(yáng)性率幾乎100%［6］。也有人利用IEC和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的差異并聯(lián)合應(yīng)用膠原酶消化的方法獲得了高純度的IEC細(xì)胞［7］。本試驗(yàn)應(yīng)用嗜熱菌蛋白酶獲得大量的腸隱窩細(xì)胞團(tuán)。要分離腸隱窩細(xì)胞團(tuán)，所以在離心過(guò)程中，可根據(jù)單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊的大小及比重不同，通過(guò)控制離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間把較大的團(tuán)塊離心下來(lái)，而小的單細(xì)胞仍在上清中，這樣可以去除部分單細(xì)胞，在分離階段對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初步純化。通過(guò)離心后檢測(cè)上清發(fā)現(xiàn)設(shè)置的4個(gè)離心條件中1200r·min－1離心5min上清中單細(xì)胞較多且?guī)缀鯚o(wú)團(tuán)塊，可確定為分離雞胚盲腸上皮細(xì)胞的最佳離心條件。通過(guò)控制離心條件結(jié)合差速貼壁純化可以去除大部分成纖維細(xì)胞，達(dá)到純化上皮細(xì)胞的目的。除以上方法外，提高細(xì)胞接種密度也是一種簡(jiǎn)單、有效的純化方法。接種密度低時(shí)，細(xì)胞團(tuán)簇小且稀疏，細(xì)胞鋪展速度慢，細(xì)胞團(tuán)簇間空域很早就出現(xiàn)成纖維細(xì)胞或其他非目標(biāo)細(xì)胞；接種密度高時(shí)，成纖維細(xì)胞不能形成優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)前期篩選出的細(xì)胞種植密度為每毫升2×105個(gè)團(tuán)塊，也有助于上皮細(xì)胞純化。

通過(guò)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在接種后第3～14天鋪路石樣細(xì)胞逐漸呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，可認(rèn)為細(xì)胞生長(zhǎng)良好。但僅憑光學(xué)顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察不能完全鑒定為腸上皮細(xì)胞，也無(wú)法計(jì)算上皮細(xì)胞純度。堿性磷酸酶是腸上皮細(xì)胞微絨毛上的標(biāo)志性酶，可用于上皮細(xì)胞鑒定和純度觀察。堿性磷酸酶染色法包括鈣鈷法和偶氮偶聯(lián)法，本實(shí)驗(yàn)所用的偶氮偶聯(lián)法具有時(shí)間短，穩(wěn)定，靈敏，不需要對(duì)照，不易彌散，圖象清晰的特點(diǎn)［8］。一般認(rèn)為上皮細(xì)胞純度達(dá)到60%，可為體外進(jìn)一步研究上皮細(xì)胞的功能提供較為理想的模型［9］。本研究培養(yǎng)的雞胚盲腸上皮細(xì)胞純度達(dá)72%以上，可為E．tenella體外培養(yǎng)研究提供依據(jù)。

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