張晉強，牛麗，宋美琴，白喜云

（1．山西農(nóng)業(yè)大學 信息學院，山西 太谷030801；2．山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷030801）

近年來，人們對病毒的研究越來越深入，包括在細胞模型上高通量篩選抗病毒藥物并且進一步在細胞水平以及分子水平上研究病毒致病機制、藥物抗病毒機制等方面進行大量研究［1］。不管是對病毒進行哪方面的研究，確保病毒感染是首要環(huán)節(jié)，而吸附是啟動病毒感染的第一步，也是決定病毒感染成功與否的關鍵環(huán)節(jié)。研究藥物與病毒作用的時效關系［2］可以從一定程度闡明藥物的抗病毒機制，而病毒在細胞上的吸附時間的確定對于闡明藥物的抗病毒機制具有一定的指導作用。所以，測定病毒在細胞上達到最大吸附量所需時間對病毒的研究具有重要的價值。

病毒吸附細胞的時間對病毒感染細胞的能力有明顯影響，不同的病毒完成吸附過程所需時間不等，一般不超過120min，如西方型馬腦炎病毒感染雞胚成纖維細胞，其30min的吸附率達到了85%；狂犬病毒感染BHK－21細胞，也可在30min內(nèi)完成吸 附［3］。Ⅰ 型IBDV 在雞胚 腎 （Chicken embryo kidney cells，CEK）細胞上37℃孵育 75 min時可以達到病毒的最大吸附量；Ⅰ型和Ⅱ型IBDV接種于Vero上37℃孵育70min時可以達到病毒的最大吸附量［4］。但是IBDV在雞胚成纖維細 胞 （Chicken enbryos fibroblasts，CEF）上、MDV在 CEF上、PRRSV 在 Marc－145上以及PRV在PK－15上達到最大吸附量所需時間至今還未見報道。

本試驗將通過觀察病毒在細胞上吸附不同時間后產(chǎn)生的細胞病變情況測定這4種病毒在細胞上達到最大吸附量所需時間。

1 材料與方法

1．1 細胞

1．1．1 雞胚成纖維細胞（CEF）

取9～11日齡的雞胚，將外部消毒，在超凈臺內(nèi)小心取出雞胚，放在無菌培養(yǎng)皿中，除去頭部、翅膀及內(nèi)臟；剪切成1～2mm3的小塊體積，用PBS緩沖液洗滌后置于錐形瓶中，加入0．25%胰蛋白酶消化液，于37℃水浴鍋內(nèi)消化，待組織塊呈蓬松茸毛狀時終止消化，棄去胰酶并加入適量的培養(yǎng)液，用彎頭吸管反復吹打后經(jīng)200目過濾篩過濾；取少量細胞懸液進行計數(shù)，以1×106個·mL－1的細胞密度接種并置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．1．2 細胞系

Marc－145細胞（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）的傳代：棄去培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液，加入適量PBS沖洗后加入1mL胰酶對細胞進行消化，輕搖細胞培養(yǎng)瓶使瓶底細胞都充分接觸胰酶，37℃消化約2 min，棄去胰酶，加入含有10%FBS的培養(yǎng)液后用吸管將細胞單層吹打成細胞懸液，分裝后于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

PK－15細胞（豬腎細胞，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）的傳代于37℃消化約3～4min，其它同Marc－145細胞。

1．2 病毒

傳染性法氏囊病毒（IBDV）（B87株）疫苗，浙江易邦生物有限公司生產(chǎn)，批號為（2007）110572026。將IBDV疫苗毒在雞胚成纖維細胞上傳代2次，按Reed－Muench法［5］測定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）備用。

雞馬立克氏病毒（MDV－1）弱毒疫苗，北京翎羽禽病防治技術有限公司生產(chǎn)，批號為XLYB003。將MDV－1型疫苗毒在CEF上傳代2次，測出其毒力備用。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）（JXAI－R株）疫苗，廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司生產(chǎn)，批號為1012001。將PRRSV疫苗毒在Marc－145細胞上擴增后，按Reed－Muench法測定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）備用。

豬偽狂犬病毒（Pig pseudo rabies virus，PRV）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)查所的標準毒株。將毒株在PK－15細胞上擴增后，按Reed－Muench法測定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）備用。

1．3 試劑

DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品，加入四季青胎牛血清，血清濃度達到5%的為細胞培養(yǎng)液、2%為細胞維持液。按照常規(guī)劑量加入谷氨酰胺和雙抗。胰蛋白酶，用PBS（pH 為7．2～7．4）配制成0．25%的溶液，濾器過濾除菌，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（SL shellab，USA），倒置顯微鏡（OLYMPUS IX81，Japan），96 孔 細 胞 培 養(yǎng) 板（Corning，USA）。

1．5 試驗方法

1．5．1 IBDV在CEF上達到最大吸附量所需時間的測定

按照每組4個重復，將CEF細胞數(shù)調整至1×106個·mL－1后加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h，棄掉孔內(nèi)液體，用PBS沖洗3次，按照每孔100μL加入100TCID50的IBDV病毒液，置于培養(yǎng)箱中孵育，分別在孵育15、30、45min、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4、4．5、5h后，將病毒液棄去，PBS沖洗3次后加入新鮮維持液。另設病毒對照組（加入病毒液后不做處理）、細胞對照組（不加病毒加維持液）。加樣完畢后繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細胞病變情況。當病毒對照出現(xiàn)70%～80%的細胞病變時，觀察并記錄試驗孔細胞病變情況。

1．5．2 MDV在CEF上達到最大吸附量所需時間的測定

制備CEF后將細胞密度調整至1．5×106·mL－1，按照500μL·孔－1接種于24孔板，置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)24h。將 MDV病毒液按照100PFU·孔－1接種于CEF上，分別在孵育15、30、45min、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5、5．0h后，將病毒液棄去，PBS沖洗3次后加入新鮮維持液。另設病毒對照組（加入病毒液后不做處理）、細胞對照組（不加病毒加維持液）。加樣完畢120h后觀察細胞病變情況。

1．5．3 PRRSV 在 Marc－145細胞上達到最大吸附量所需時間的測定

按照1．5×105·mL－1接種細胞［6］，待細胞長成單層后，接種稀釋度為100TCID50的病毒液，100 mL·孔－1，病毒吸附時間從15min至4．0h。每15min為吸附時間間隔，每個時間間隔接種6孔，棄病毒液，PBS沖洗3次，換2%的維持液于5%CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE情況，待100TCID50病毒對照組病變達70%～80%時，終止試驗。

1．5．4 PRV在PK－15細胞上達到最大吸附量所需時間的測定

按照每組4個重復，將PK－15細胞數(shù)調整至1×105個·mL－1后加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24．0h，倒掉孔內(nèi)液體，用PBS沖洗3次，按照每孔100μL加入100TCID50的PRV病毒液，置于培養(yǎng)箱中孵育。病毒吸附時間從15min至4．0h。每15min為吸附時間間隔，每個時間間隔接種6孔，棄病毒液，PBS沖洗3次，換2%的維持液于5%CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE情況，待100TCID50病毒對照組病變達70%～80%時，終止試驗。

2 結果

2．1 IBDV在CEF上達到最大吸附量所需時間的測定

吸附了15min、30min、45min試驗組細胞病變程度依次增大，但均比病毒對照組細胞病變情況輕微；吸附60min及其后面實驗組細胞病變與病毒對照細胞病變情況相當（圖1）；結果表明IBDV在CEF上37℃孵育60min時，IBDV的吸附量達到最大值。

圖1 各組細胞病變Fig．1 Result of adsorption time of IBDV on CEF

2．2 MDV在CEF上達到最大吸附量所需時間的測定

從吸附15min到120min的試驗孔，病變越來越重，至120min時達到峰值，之后不再加深。所以MDV在CEF上37℃孵育120min時，MDV的吸附量達到最大值。

2．3 PRRSV在Marc－145上達到最大吸附量所需時間的測定

當100TCID50對照組的病變達到70%～80%時：吸附時間從15min到60min細胞病變程度遞增但均未達到100TCID50對照組病變程度。吸附時間為60min時，細胞病變程度與病毒對照一致。最終確定病毒的最佳吸附時間為60min。

2．4 2．4 PRV在PK－15細胞上達到最大吸附量所需時間的測定

吸附時間從15min到60min細胞病變程度隨著吸附時間的延長而加重，但均未達到病毒對照組病變程度。吸附時間大于60min時，細胞病變程度與病毒對照一致，所以確定病毒的最佳吸附時間為60min。孵育75min時可以達到病毒的最大吸附量，Ⅰ型和Ⅱ型IBDV接種于Vero上37℃孵育70min時可以達到病毒的最大吸附量。本實驗中37℃條件下孵育測得IBDV病毒在CEF上達到最大吸附量所需時間為60min。與之前報道出現(xiàn)略微差異可能是因為試驗所選用的細胞與之前報道試驗所用細胞不同以及所用病毒與報道試驗所用病毒不同而造成。

有文章報道PRV在Vero細胞上所需吸附時間為1h［6］，在 PK 細胞上吸附1．5h［7］，PRRSV NVDC－JXA1株在 Marc－145上吸附30min［8］，可能由于實驗條件、試驗所用細胞系以及病毒毒株等差異造成實驗結果略有不符；MDV在CEF上吸附2h［9］。本試驗測定 MDV在CEF上達到最大吸附量所需時間為120min與報道相符。

在本試驗中，隨著吸附時間的延長，試驗孔病變加重；到一定時間后病變程度不再隨著時間的延長而加重，說明病毒吸附量已經(jīng)達到最大值。不同的病毒完成吸附細胞的時間不等，一般不超過120min［3］。

3 討論

之前有報道Ⅰ型IBDV在雞胚腎細胞上37℃

［1］羅俊，滕蔓，樊劍鳴，等．雞傳染性法氏囊病病毒在 DT40細胞中的增殖規(guī)律［J］．畜牧獸醫(yī)學報，2009，40（8）：1276－1280．

［2］Salim MT，Goto Y，Hamasaki T，Okamoto M，Aoyama H，Hashimoto Y，Musiu S，Paeshuyse J，Neyts J，F(xiàn)roeyen M，Herdewijn P，Baba M．Highly potent and selective inhibition of bovine viral diarrhea virus replication byγ－carboline derivatives［J］．Antiviral Research，2010，88：263－268．

［3］徐耀先，周曉峰，劉立德．分子病毒學［M］．武漢：湖北科學技術出版社，2000：67－159．

［4］黃金海，李健強．傳染性法氏囊病病毒在細胞中的增殖及其分子機制［J］．動物醫(yī)學進展，1999，20（2）：20－24．

［5］胡元亮，劉國家，陳玉庫，等．中藥成分對傳染性法氏囊病毒感染細胞的影響［J］．畜牧與獸醫(yī)，2003，35（12）：8－10．

［6］Iwata K，Naito E，Yamashita K，et al．Takase K ．Anti pseudorabies virus activity of kumazasa extract［J］．Biocontrol Science，2010，15（4）：123－128．

［7］仇微紅，張盼鋒，李雪，等．大青葉板藍根等5種清熱類中藥體外抗偽狂犬病病毒效果［J］．中國獸醫(yī)雜志，2009，45（11）：37－39．

［8］朱文革，賀云霞，周振成，等．PRRSV NVDC－JXAl株在 Marc－145細胞上增殖條件的優(yōu)化［J］．動物醫(yī)學進展，2010，31（6）：66－69．

［9］褚秀玲，蘇建青．細胞病變觀察法檢測人參皂苷及其衍生物抗馬立克氏病病毒的作用［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（3）：170－183．