王皓婷 ，王水明 ，史子學(xué) ，邵東華 ，魏建超 ，劉學(xué)輝 ，王志亮 ，王雪敏 ，馬志永

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究室，上海 200241；2.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北 邯鄲056001；3. 南京出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 211106；4. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266114）

馬爾堡出血熱是由馬爾堡病毒引起的一種致死率極高的烈性傳染病。最早有關(guān)馬爾堡出血熱爆發(fā)的記錄是在1967年德國馬爾堡。據(jù)報(bào)道當(dāng)時有31人感染病毒發(fā)病，其中7人死亡。這31個感染病毒的人中有25人是由于接觸了感染馬爾堡病毒的猴子而致病的[1]。馬爾堡病毒可由人與人之間的親密接觸傳播，傳染性強(qiáng)。目前尚沒有有效的疫苗和特效的治療藥物。

感染馬爾堡病毒后，潛伏期約為5天，發(fā)病后癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、渾身發(fā)冷、頭痛、肌肉痛。隨后有些人會出現(xiàn)皮疹的癥狀，大部分人會有惡心、嘔吐、腹瀉、骨頭疼痛及腹痛等癥狀。隨著時間的推移，癥狀可能會越來越嚴(yán)重，最終導(dǎo)致大量出血及多器官功能障礙[2]。大多數(shù)病人在感染病毒后的兩周內(nèi)會死亡。病毒可通過人與人之間的直接接觸而傳播，也可通過接觸馬爾堡出血熱患者的體液或遺骸而使健康人感染[3]。到目前為止，該病毒的自然宿主尚不能確定，但多數(shù)學(xué)者懷疑與蝙蝠有關(guān)[4-5]。

馬爾堡病毒和埃博拉病毒共同構(gòu)成絲狀病毒屬，但屬兩個不同的種系[6]。馬爾堡病毒只有一種血清型。在電子顯微鏡下觀察呈不同的形態(tài)，多為長細(xì)絲狀，也有時呈卷曲的蚯蚓狀或6形、環(huán)形。病毒顆粒直徑較一致，約80～100 nm，但長度差異較大，一般為 300～1500 nm，病毒表面有一層蛋白包膜，具有抗原性[7-8]。馬爾堡病毒基因組全長約19 kb，為單股負(fù)鏈RNA病毒?；蚪M編碼7種病毒蛋白，包括核蛋白（NP）、基質(zhì)蛋白 VP24和VP40、結(jié)構(gòu)蛋白 VP30和VP35、依賴RNA的RNA多聚酶（L蛋白）、糖蛋白7（gp7）[9]。由于核蛋白有很強(qiáng)的抗原性，故將核蛋白亞克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒。成功表達(dá)后，利用His-Band Ni+柱進(jìn)行親和層析純化，獲純化蛋白，用于后續(xù)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-28（a）、大腸桿菌 DH5 α、BL21（DE3）菌體、IPTG、抗生素等由本實(shí)驗(yàn)室保存；各種限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司；T4連接酶購自Invitrogen公司；His Bank Kits蛋白質(zhì)純化試劑盒購自Novagen公司；普通質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA片段膠回收試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗為美國Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；馬爾堡病毒核蛋白基因（GenBank No： Z29337.1）由南京金思特科技有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建

在基因合成前的設(shè)計(jì)階段，將HindⅢ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)插入到馬爾堡病毒NP基因的兩端。合成的NP基因克隆至pUC57質(zhì)粒中。對PUC57-MNP質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ和EcoRⅠ的雙酶切，酶切完畢后對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒回收約2100 bp的目的片段，將回收產(chǎn)物亞克隆入pET-28（a）載體，構(gòu)建 pET-28（a）-M-NP 重組質(zhì)粒。

重組質(zhì)粒構(gòu)建好后，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，挑單克隆搖菌12 h后，提取質(zhì)粒，用HindⅢ和 EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行分析鑒定。將陽性重組質(zhì)粒送往上海桑尼公司進(jìn)行目的片段的序列測定。

1.2.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒用熱休克法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliBL21（DE3），挑取單克隆培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，按1:100 比例轉(zhuǎn)種，接種100 mL含有卡那霉素（終質(zhì)量濃度為50 g/mL）的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h。3 h后以終濃度0.5 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，以12000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5 min收菌。菌體沉淀用20 mL裂解buffer重懸，置于搖床中振蕩裂解1 h。1 h后超聲冰浴破菌。裂解后的菌液，在4 ℃下以5000 r/min離心10 min，將離心后的沉淀和上清分別收集并分別制備樣品，以10%SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況。沉淀用8 ml含6M尿素的1×Binding buffer重懸，置4 ℃過夜。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的純化

將誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白用His-Band Ni+柱進(jìn)行親和層析純化，8%SDS-PAG檢測純化效果。

1.2.4 融合蛋白的Western-blot分析

按照常規(guī)方法進(jìn)行Western-blot分析，一抗為His抗體，稀釋度為1:3000。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，稀釋度為1:5000。具體步驟參照《分子克隆試驗(yàn)指南》。

2 結(jié)果

2.1 原核重組表達(dá)載體pET-28（a）-M-NP的構(gòu)建和測序

馬爾堡病毒NP基因全長2088 bp，亞克隆入pET-28（a）載體，對重組質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ和 EcoRⅠ的雙酶切。以1%瓊脂糖凝膠電泳分析雙酶切產(chǎn)物，在與預(yù)期相符的約2100 bp 處有特異性條帶（圖1），表明馬爾堡NP基因已成功克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送往上海桑尼公司進(jìn)行序列測定后，結(jié)果表明目的片段序列正確沒有突變。

2.2 重組蛋白的表達(dá)

將鑒定后序列正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），以終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h，誘導(dǎo)前后分別取1 mL菌液制樣，以10%SDS-PAGE電泳鑒定后，證明目的蛋白成功表達(dá)（圖2）。

將pET-28（a）誘導(dǎo)后，pET-28（a）-M-NP誘導(dǎo)前后，超聲后離心的上清和沉淀分別制樣，10%SDS-PAGE檢測表達(dá)情況。圖3表明重組蛋白在上清沉淀中均有表達(dá)。上清在非變性條件下，沉淀在變性下分別純化。

2.3 NP重組蛋白的純化

用含6M尿素的1×Bingbuffer將超聲裂解后離心的沉淀重懸過夜，在變性條件下用His-Band Ni+柱進(jìn)行親和層析純化。將破菌上清在非變性條件下用His-Band Ni+柱進(jìn)行親和層析純化，10%SDS-PAGE檢測純化結(jié)果（圖4）。

2.4 重組核蛋白的Western-blot分析

融合蛋白帶有His標(biāo)簽，以Anti-His單克隆抗體對重組核蛋白進(jìn)行Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，在約97KD處有特異性反應(yīng)條帶顯現(xiàn)（圖5）。說明融合蛋白可以與Anti-His單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

3 討論

感染病毒的非人靈長類動物和病人是主要傳染源，且癥狀越重的患者傳染性越強(qiáng)，潛伏期的患者傳染性較弱。目前我國境內(nèi)尚無此病癥，但由于此病的危害性較大，建立完善檢測方法是當(dāng)務(wù)之急。

本實(shí)驗(yàn)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲取重組蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖不能完全真實(shí)反映蛋白的天然構(gòu)象，但由于此方法操作簡便成本低廉，便于大規(guī)模生產(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物易于純化且無感染性[10]。

為了便于目的蛋白的純化，在重組表達(dá)外源蛋白時引入His標(biāo)簽。His標(biāo)簽有表達(dá)方便不影響蛋白活性等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以及His標(biāo)簽作為目的蛋白的純化標(biāo)簽，所得到的重組蛋白可用于后續(xù)檢測方法的研究。

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