丁黎葭* 陳世耀# 紀(jì) 元 馬麗黎 練晶晶

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科1（200032） 病理科2 內(nèi)鏡中心3 內(nèi)科4

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells）學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是原發(fā)性腫瘤組織中一類具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化潛能的細(xì)胞亞群，是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源。Wnt信號(hào)通路參與組成干細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[1]。作為Wnt信號(hào)通路的靶基因，G蛋白偶聯(lián)受體Lgr5（leucinerich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5）主要表達(dá)于肌肉、胎盤(pán)、脊髓、腦組織中[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)Lgr5為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物之一[3]，與相應(yīng)正常組織相比，人原發(fā)性結(jié)腸癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌中存在Lgr5過(guò)表達(dá)[4,5]，提示Lgr5與腫瘤的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。Becker等[6]的研究顯示，Barrett食管中存在Lgr5表達(dá)，在Barrett食管相關(guān)高度異型增生和食管腺癌中，其表達(dá)較Barrett食管顯著增強(qiáng)，并與食管腺癌預(yù)后不良獨(dú)立相關(guān)，提示Lgr5有作為Barrett食管相關(guān)異型增生和食管腺癌生物學(xué)標(biāo)記的潛能。本研究旨在探討Lgr5在Barrett食管和早期食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

Barrett食管和早期食管鱗癌組織標(biāo)本均源自2007年1月～2009年12月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心接受內(nèi)鏡檢查或治療的病例，診斷經(jīng)活檢病理或內(nèi)鏡手術(shù)病理檢查證實(shí)。癌旁組織取自距癌灶邊緣3 cm以內(nèi)處，經(jīng)病理檢查證實(shí)為非癌組織（多為異型增生組織）。Barrett食管20例，其中男14例，女6例，年齡39～81歲，中位年齡58歲。早期食管鱗癌20例，其中男12例，女8例，年齡48～76歲，中位年齡60歲；原位癌7例，黏膜內(nèi)癌10例，黏膜下癌3例。選取同期輕度食管炎組織標(biāo)本20例作為對(duì)照，其中男10例，女10例，年齡45～84歲，中位年齡56歲。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.Barrett食管[7]：內(nèi)鏡檢查示鱗、柱狀上皮交界與胃食管連接部分離，即胃食管連接部近端出現(xiàn)橘紅色胃柱狀上皮，以四象限法取活檢，病理檢查證實(shí)存在含杯狀細(xì)胞的腸化生。

2.早期食管癌[8]：內(nèi)鏡檢查示食管黏膜粗糙、糜爛或顆粒狀隆起，碘液染色不著色，內(nèi)鏡手術(shù)病理檢查證實(shí)為原位癌（腫瘤局限于鱗狀上皮層內(nèi)，未突破基底膜）、黏膜內(nèi)癌（腫瘤侵及黏膜固有層或黏膜肌層）或黏膜下癌（腫瘤侵及黏膜下層的上1/3）。

3.輕度食管炎[9]：內(nèi)鏡檢查示食管黏膜呈點(diǎn)狀或條狀發(fā)紅、糜爛，但無(wú)融合現(xiàn)象（內(nèi)鏡分級(jí)Ⅰ級(jí)）；活檢病理檢查可見(jiàn)鱗狀上皮增生、黏膜固有層乳頭延伸和上皮細(xì)胞層內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)黏膜糜爛、潰瘍形成，無(wú)Barrett食管改變。

三、Lgr5免疫組化染色

采用免疫組化EnVision二步法（ChemMateTMEnVisionTMDetection Kit,Dako公司）。甲醛固定石蠟包埋組織每隔2 mm連續(xù)切片，切片厚4 μm。切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，微波抗原修復(fù)，滴加工作濃度為1:50的兔抗人 Lgr5多克隆抗體（Sigma-Aldrich Co.），37 ℃孵育1 h，滴加HRP標(biāo)記的ChemMateTMEnVision二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知Lgr5染色陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

結(jié)果判斷[6]：細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)均勻一致的棕色顆粒定義為L(zhǎng)gr5染色陽(yáng)性。于40倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度分別行半定量評(píng)分，結(jié)果取均值。陽(yáng)性細(xì)胞比例0～10%、11%～30%、31%～60%、61%～100%分別計(jì) 0～3分；染色強(qiáng)度按無(wú)、弱（淺棕色）、中（棕色）、強(qiáng)（深棕色）分別記0～3分（相應(yīng)染色強(qiáng)度的細(xì)胞比例必須>10%）?？偡譃閮身?xiàng)計(jì)分之和。兩項(xiàng)計(jì)分均≥1分判斷為L(zhǎng)gr5表達(dá)陽(yáng)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，Barrett食管與輕度食管炎組間比較采用成組t檢驗(yàn)，早期食管鱗癌與相應(yīng)癌旁組織組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，原位癌、黏膜內(nèi)癌與黏膜下癌組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

Lgr5在腺上皮中表達(dá)于腺體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在鱗狀上皮中表達(dá)于鱗狀細(xì)胞的細(xì)胞核。

20例輕度食管炎組織中，16例腺上皮Lgr5表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞分布分散（見(jiàn)圖1）。20例Barrett食管組織中，18例腺上皮Lgr5表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞分布密集（見(jiàn)圖2）。Barrett食管組織腺上皮Lgr5免疫組化評(píng)分高于輕度食管炎組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3.65±1.95 對(duì) 2.55±1.70,P=0.049）。

20例早期食管鱗癌中，18例癌灶組織及其相應(yīng)癌旁組織鱗狀上皮Lgr5表達(dá)陽(yáng)性。癌旁組織Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞集中于鱗狀上皮層近基底部，癌灶組織則不再局限于基底部（見(jiàn)圖3）。癌灶組織Lgr5免疫組化評(píng)分高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5.39±0.61 對(duì) 3.06±1.06,P=0.000）。原位癌、黏膜內(nèi)癌與黏膜下癌間Lgr5免疫組化評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5.00±0.63、5.56±0.53 和 6.00±0.58,P=0.174）。

討 論

Lgr5為G蛋白偶聯(lián)受體，由907個(gè)氨基酸組成，其特征性結(jié)構(gòu)為七次跨膜結(jié)構(gòu)域以及含17個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的外功能區(qū)。作為Wnt信號(hào)通路的靶基因和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，Lgr5與多種惡性腫瘤，包括人結(jié)腸癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、食管腺癌的發(fā)生有關(guān)[4～6]。

經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路為 Wnt/β-連環(huán)蛋白（βcatenin）信號(hào)通路。無(wú)Wnt信號(hào)時(shí)，β-catenin與胞質(zhì)中的Axin/APC/GSK-3β復(fù)合物結(jié)合，經(jīng)磷酸化、泛素化后降解；經(jīng)Wnt信號(hào)刺激，Wnt蛋白與細(xì)胞表面的Frizzled/LRP受體復(fù)合物結(jié)合，拮抗Axin/APC/GSK-3β復(fù)合物形成，阻礙β-catenin的降解，胞質(zhì)內(nèi)非磷酸化的β-catenin進(jìn)入胞核，與LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄[10]。

Wnt信號(hào)通路參與維持成體干細(xì)胞的增殖、分化，并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用[11]。彭輝等[12]對(duì)食管鱗癌中Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的研究顯示，β-catenin表達(dá)異常始于異型增生階段；隨著腫瘤分化程度由高至低的改變，APC陽(yáng)性率逐漸減低，β-catenin陽(yáng)性率逐漸增加。Wang等[13]的研究亦發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中Wnt2/β-catenin信號(hào)通路被激活，抑制β-catenin的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明Wnt信號(hào)通路對(duì)食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要調(diào)控作用，同時(shí)提示食管鱗癌的發(fā)生可能與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。

Barker等[14]的研究發(fā)現(xiàn)作為Wnt信號(hào)通路靶基因的Lgr5是小鼠腸干細(xì)胞的標(biāo)記基因。Lgr5在小鼠腸道中僅表達(dá)于隱窩基底部的柱狀細(xì)胞，這些柱狀細(xì)胞因能向所有腸上皮譜系分化而被認(rèn)為是腸干細(xì)胞。Becker等[15]以免疫組化方法研究了人胃腸道癌前病變中的Lgr5表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)小腸、結(jié)腸腺瘤和Barrett食管中Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，且分布不再如正常組織一樣局限于隱窩基底部的干細(xì)胞池。其后相關(guān)研究[6]顯示，Lgr5在Barrett食管相關(guān)高度異型增生和食管腺癌中的表達(dá)較Barrett食管顯著增強(qiáng)，表達(dá)率增高。有研究[16]發(fā)現(xiàn)腸道中存在不同Lgr5表達(dá)強(qiáng)度的細(xì)胞群體，但僅Lgr5高表達(dá)的細(xì)胞同干細(xì)胞一樣，在體外實(shí)驗(yàn)中具有重建腸隱窩的能力。因此，Barrett食管相關(guān)高度異型增生組織中增多的Lgr5高表達(dá)細(xì)胞可能是有成為腫瘤干細(xì)胞傾向的干細(xì)胞。干細(xì)胞的分布不再局限于干細(xì)胞池為其發(fā)生癌前轉(zhuǎn)化的早期事件。

本研究中Barrett食管組織腺上皮Lgr5表達(dá)評(píng)分顯著高于輕度食管炎組織，染色定位于細(xì)胞質(zhì)，結(jié)合Becker等[6]報(bào)道的Barrett食管相關(guān)高度異型增生和食管腺癌的Lgr5表達(dá)強(qiáng)度顯著高于Barrett食管，支持Lgr5可作為食管腺癌及其癌前病變的生物學(xué)標(biāo)記。Becker等[6]的研究顯示正常食管鱗狀上皮中無(wú)Lgr5表達(dá)，而本研究發(fā)現(xiàn)輕度食管炎、Barrett食管和早期食管鱗癌組織的鱗狀上皮中均有Lgr5表達(dá)，染色定位于細(xì)胞核，這一差異可能與兩項(xiàng)研究預(yù)處理等步驟中使用的相關(guān)試劑對(duì)抗原表位的保護(hù)程度不同有關(guān)。早期食管鱗癌原位癌灶組織中Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于相應(yīng)癌旁組織且染色較深，Lgr5表達(dá)評(píng)分亦顯著高于癌旁組織，提示Lgr5可能作為腫瘤標(biāo)記物輔助診斷早期食管鱗癌。原位癌、黏膜內(nèi)癌與黏膜下癌間Lgr5表達(dá)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與納入樣本例數(shù)過(guò)少有關(guān)。

根據(jù)腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與腫瘤干細(xì)胞的存在密不可分，腫瘤轉(zhuǎn)移的不可預(yù)知性及其機(jī)制的復(fù)雜性，根本原因在于只有腫瘤干細(xì)胞才具有在相鄰區(qū)域或遠(yuǎn)隔部位形成轉(zhuǎn)移灶的能力。由于本研究納入的食管鱗癌樣本數(shù)量有限且均為早期病例，關(guān)于Lgr5的表達(dá)與食管鱗癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系，以及Lgr5與Wnt信號(hào)通路中的β-catenin等相關(guān)蛋白對(duì)腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制及其在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的意義，均有待后續(xù)研究進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

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