居峰 吳劍吳文宏周曉霞

（1江蘇省靖江市人民醫(yī)院，江蘇 靖江 214500；2揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225001）

近年來，心腦血管疾病己成為當(dāng)今世界上威脅人類健康最嚴重的疾病之一，其中動脈粥樣硬化（arteriosclerosis，AS）的發(fā)病率和死亡率位居前列。血管內(nèi)皮細胞損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙不僅是AS的一個始動環(huán)節(jié)，還是導(dǎo)致其不斷進展的重要因素。因此，改善和恢復(fù)血管內(nèi)皮功能已經(jīng)成為AS防治的重要目標之一。

在眾多導(dǎo)致AS的危險因素中，高甘油三酯血癥（HTG）與AS的關(guān)系則一直頗有爭議。近年來，國內(nèi)外一些新的流行病學(xué)研究資料及病理學(xué)研究表明，HTG是AS發(fā)生的獨立危險因素并在AS斑塊中發(fā)現(xiàn)有富含甘油三酯脂蛋白的類似物存在[1]。然而，在細胞水平上，高甘油三酯血清（High triglyceride blood serum，HTGBS）是否可直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷的相關(guān)研究報道甚少，故本研究采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human vascular endothelial cell，HUVEC），觀察單純HTGBS對血管內(nèi)皮細胞活力、通透性、氧化及抗氧化能力和分泌功能等方面的影響。

近年來，血紅素氧化酶-1/一氧化碳（hemeoxygenase-1，HO-1/CO）系統(tǒng)在心血管疾病中的作用受到了廣泛的關(guān)注。HO-1與其作用產(chǎn)物CO、鐵、膽綠素、膽紅素涉及許多生理和病理過程。本文將在細胞水平上初步觀察HTG所致HUVEC氧化損傷對HO-1/CO系統(tǒng)的影響，進一步探討HTGBS致AS的機制。

1 實驗材料

HUVEC細胞株由南京醫(yī)科大學(xué)提供；DMEM購自Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；MTT購自Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HO-1（M-19）購自Santa Cruz公司。

2 實驗方法

2.1 HTGBS的收集與處理

從醫(yī)院收集人的正常血清及HTGBS，分別置于56℃水浴30 min滅活處理，并用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。血清中的甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）及血糖（GLU）指標均由醫(yī)院檢驗科全自動生化分析儀檢測。

2.2 HUVEC的傳代培養(yǎng)

將HUVEC細胞株培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中。待細胞生長至近匯合狀態(tài)、鋪滿瓶壁80%以上時，進行傳代。

2.3 MTT法檢測HTGBS對HUVEC活力的影響

2.3.1 實驗分組

①陰性對照組：5%人正常血清；

②梯度濃度的HTGBS組：分別含HTGBS 1%、2%、3%、4%、5%（血清終濃度為5%，不足5%的部分用人正常血清補充）；

③空白對照組：5%人正常血清（不加細胞只加培養(yǎng)基）。

2.3.2 操作步驟 細胞以5×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，用含5%人正常血清的DMEM培養(yǎng)24 h后，換無血清DMEM（每組6孔）繼續(xù)培養(yǎng)。靜止培養(yǎng)24 h后按分組加入含不同濃度血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h；實驗結(jié)束后每孔加入 MTT溶液（5 g/L）20 μL，37℃繼續(xù)孵育 4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，振蕩均勻后于酶標儀490 nm波長測吸光度（absorbance，A）值。

2.4 細胞中LDH活性、MDA含量和SOD活性的測定

分組同上，按說明書采用化學(xué)比色法測定細胞中LDH活性；硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）法測定MDA含量；黃嘌呤氧化酶法檢測細胞內(nèi)SOD活性。

2.5 細胞中NO含量、總一氧化氮合酶（TNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS）活性的測定

分組同上，用硝酸還原法測定細胞血管內(nèi)NO含量；用化學(xué)比色法測定內(nèi)皮細胞中TNOS和iNOS活性。

2.6 ELISA測定碳氧血紅蛋白（Carboxyhemoglobin，COHb）的含量

溶液中的CO很容易與血紅蛋白結(jié)合生成 COHb，通過測定培養(yǎng)基中COHb含量可以間接反映CO的生成，COHb測定參照Morita等[2]方法：消化單層培養(yǎng)細胞，以5×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，用含5%人正常血清的DMEM培養(yǎng)24 h后，換無血清DMEM靜止培養(yǎng)24 h，實驗分組同上（每組6孔），加入血清后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗結(jié)束前1 h每孔加入牛血紅蛋白50 μmol/L，選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔培養(yǎng)上清液的A值。

2.7 Western Blot檢測蛋白表達

細胞以5×104/mL密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶，用含5%人正常血清的DMEM培養(yǎng)24 h后，換無血清DMEM靜止培養(yǎng)24 h，實驗分組同上，加入血清后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞收集在1.5 mL EP管，按說明書加入RIPA裂解液和PMSF，冰上裂解 30 min，4℃，12 000 rpm/min 離心 15 min，收集上清轉(zhuǎn)移到0.5 mL EP管，每組取100 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳。PVDF膜濕轉(zhuǎn)（Bio-Rad），350 mA轉(zhuǎn)100 min，室溫封閉 1 h，一抗 4℃冰箱孵育過夜（1∶500），洗膜后二抗室溫孵育2 h（1∶500），洗膜后二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理分析，計量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 人血清中 TC、TG、GLU的含量

與正常血清相比，單純HTGBS中僅TG明顯升高（P＜0.01），其余指標屬于正常范圍，見表1。

表1 混合血清中TC、TG、GLU的含量（±s）

表1 混合血清中TC、TG、GLU的含量（±s）

注：與正常血清組相比：*P＜0.01

分組（n=100）TC（mmol/L）TG（mmol/L）GLU（mmol/L）正常血清 4.51±0.03 1.25±0.02 5.2±0.13高甘油三酯血清 4.68±0.02 3.58±0.02* 5.0±0.10正常范圍 2.3～5.7 0.55～1.82 3.9～6.1

3.2 相差顯微鏡下HUVEC形態(tài)

正常血管內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)良好，貼壁較牢，細胞間連接緊密；細胞呈多角形或短梭形，邊界清楚，大小均勻，呈單層鋪路石樣鑲嵌排列；胞核圓形或橢圓形，位于細胞中央，多核仁；胞漿豐富（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡下HUVEC形態(tài)（×100）

3.3 MTT法檢測HTGBS對HUVEC活力的影響

經(jīng)無血清抑制處理的HUVEC給予含5%正常血清（Control組）和含 1%、2%、3%、4%、5%HTGBS的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后490 nm處測得吸光度值，結(jié)果如圖2所示：1%，2%，3%的HTGBS可小幅度促進HUVEC增殖，但4%、5%HTGBS明顯抑制HUVEC活力，與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。由此確定HTGBS致HUVEC損傷的最佳實驗濃度5%，最佳作用時間為24 h。

圖2 不同濃度的HTGBS對HUVEC活力（MTT法測A值）的影響（±s,n=6）

3.4 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響

測定結(jié)果如表2所示：與正常對照組相比，HTGBS使得細胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯升高（P＜0.01）；血管內(nèi)皮細胞中SOD活性降低，膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加（P＜0.01）。

表2 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響（±s）

表2 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響（±s）

注：與Control組相比：*P＜0.01

分組(n=6)LDH(U/g prot)MDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg prot)Control 0.128±0.014 0.261±0.033 20.083±1.909 HTGBS 0.277±0.030* 0.682±0.059* 15.959±2.084*

3.5 HTGBS對HUVEC中NO含量、TNOS和iNOS活性的影響

測定結(jié)果如表3所示：與正常對照組比較，HTGBS使HUVEC中NO含量、TNOS活性明顯降低（P＜0.01）；iNOS活性升高（P＜0.01）。

表3HTGBS對HUVEC中NO含量、TNOS和iNOS活性的影響（±s）

注：與Control組相比：*P＜0.01

3.6 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達及細胞培養(yǎng)液中COHb含量的影響

測定結(jié)果如表4，圖3所示：與正常對照組比較，HTGBS組HUVEC中HO-1蛋白表達代償性升高，細胞培養(yǎng)液中的COHb含量明顯增加（P＜0.01）。

表4 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達及細胞培養(yǎng)液中COHb 含量的影響（±s）

表4 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達及細胞培養(yǎng)液中COHb 含量的影響（±s）

注：與Control組相比：*P＜0.01

分組(n=6)HO-1蛋白表達(A值之比)COHb含量(A值)Control 0.640±0.042 0.136±0.016 HTGBS 0.828±0.063* 0.275±0.023*

圖3 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達的影響（±s,n=6)

4 討論

AS已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的常見疾病。其發(fā)病機制復(fù)雜，諸多因素參與其中，而內(nèi)皮細胞損傷作為始動環(huán)節(jié)之一已被公認[3]。內(nèi)皮細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性是維持內(nèi)皮正常功能的前提，內(nèi)皮細胞損傷的原因較多，高脂血癥作為引發(fā)動脈粥樣硬化及心腦缺血性疾病的重要因素之一，主要在于其對內(nèi)皮細胞的損傷作用。高脂血癥可表現(xiàn)為高膽固醇血癥（HTC）、HTG或兩者兼有?，F(xiàn)有的文獻關(guān)于HTC與AS的關(guān)系研究比較透徹，而HTG與AS的關(guān)系則一直頗有爭議。我國膳食以高糖低脂為特點，血脂紊亂以內(nèi)源性甘油三酯升高最為多見，因此研究HTG在AS發(fā)病中的作用機制及其防治具有特別的重要意義。鄭關(guān)毅等[4]的研究表明，單純性HTG患者和高血壓伴HTG的病人存在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強、抗氧化酶活性降低。目前已有實驗研究[5]證實，HTG患者及實驗性HTG動物體內(nèi)均存有明顯的脂質(zhì)過氧化損傷，包括血漿脂質(zhì)過氧化物以及氧化修飾脂蛋白如氧化修飾低密度脂蛋白（LDL）、氧化修飾極低密度脂蛋白（VLDL）等含量增加。這些氧化修飾的脂蛋白均可以損傷血管內(nèi)皮細胞，促進AS的形成。

MTT法是一種檢測細胞存活和生長增殖情況的方法，細胞活力（A值）能間接反映細胞的增殖和存活情況。LDH是糖酵解過程中一種重要的酶，廣泛存在于細胞漿中，當(dāng)細胞膜損傷、通透性增加時，胞漿中的LDH才大量釋放到細胞外，因此細胞培養(yǎng)液中LDH活性的高低是反應(yīng)細胞受損傷程度的一個非常靈敏的指標。本實驗結(jié)果表明1%、2%、3%的HTGBS雖可小幅度促進HUVEC增殖，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但4%、5%HTGBS明顯抑制血管內(nèi)皮細胞活力，與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），因此以本實驗為基礎(chǔ)，確定以含5%HTGBS為最佳實驗濃度；HTGBS組細胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯高于正常對照組（P＜0.01），本實驗結(jié)果表明HTGBS可使血管內(nèi)皮細胞活力降低并致細胞損傷使其通透性增加。

MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量的多少可反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是機體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，主要清除O-2，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。SOD活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，對兩者結(jié)果分析具有一定生物學(xué)意義。本實驗研究結(jié)果表明，HTGBS組細胞中SOD活性明顯低于正常對照組（P＜0.01），MDA含量明顯高于正常對照組（P＜0.01），提示HTGBS可顯著增加脂質(zhì)過氧化物含量并降低細胞的抗氧化能力。

正常生理情況下NO是由血管內(nèi)皮細胞合成分泌的一種重要的信使分子和效應(yīng)分子，執(zhí)行重要的生物功能，包括擴張血管、抗血小板聚集、抑制平滑肌細胞增殖等，其生物合成主要受NOS的調(diào)節(jié)。生物組織中已經(jīng)確定的NOS亞型有3種：神經(jīng)元型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）、iNOS，前兩者又合稱為結(jié)構(gòu)型 NOS（cNOS），三者總稱TNOS。

在AS病變發(fā)展過程中，內(nèi)皮功能受損，內(nèi)皮源性cNOS表達或活性下降，內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生減少，而iNOS活性增加，產(chǎn)生大量NO自由基，刺激細胞凋亡和膠原組織降解，促進AS的形成，NO自由基還可與O-2反應(yīng)形成過氧化亞硝酸鹽，引起組織損傷。NOS在AS的發(fā)病機制方面有著雙重作用：在正常情況下，eNOS催化產(chǎn)生低濃度的NO，這對機體抗AS是有益的[6-8]；然而在高脂血癥、AS時，它通過依賴于四氫生物嘌呤（BH4）途徑而形成超氧化物[9-10]。如果再加上局部iNOS的活化，將會導(dǎo)致粥樣硬化斑塊內(nèi)高濃度的有細胞毒作用的過氧化亞硝酸鹽形成。最近 Bohr-Roussel、B?ger RH等[11-12]給高膽固醇喂養(yǎng)的兔長期應(yīng)用iNOS特異的抑制劑2周后，發(fā)現(xiàn)AS斑塊、主動脈內(nèi)膜/中膜比例與正常對照組相比無差異，這表明iNOS抑制劑確能限制高膽固醇兔的AS進程。本實驗研究結(jié)果表明，HTGBS組HUVEC中內(nèi)皮依賴性舒張因子NO含量、TNOS活性與正常對照組相比明顯降低（P＜ 0.01）；i-NOS活性與正常對照組相比明顯升高（P＜0.01）。初步提示HTGBS可以通過降低TNOS的活性，增加iNOS活性，直接或間接地減少內(nèi)源性NO的合成與釋放。

HO是血紅素降解起始酶和最為重要的限速酶。它降解血紅素產(chǎn)生CO、膽綠素和鐵離子。HO在人體內(nèi)廣泛存在，參與多種生理和病理過程，與心血管疾病有著密切的聯(lián)系。HO-1源性的CO在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，可通過調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)的緊張度，發(fā)揮心腦血管保護作用[13]。本實驗在細胞水平上初步觀察HTGBS所致HUVEC氧化損傷對HO-1/CO系統(tǒng)的影響，Western Blot結(jié)果顯示，與正常對照組比較，HTGBS組HUVEC中HO-1蛋白表達代償性升高，細胞培養(yǎng)液中的CO含量明顯增加，實驗結(jié)果初步提示，HTGBS損傷的HUVEC中HO-1表達上調(diào)是細胞代償性保護性反應(yīng)。

綜上所述，HTGBS不僅能降低細胞的抗氧化能力，增加脂質(zhì)過氧化物的生成損傷血管內(nèi)皮細胞，代償性上調(diào)細胞HO-1蛋白表達，并且可以通過影響NO/NOS系統(tǒng)從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。

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