楊國平 應(yīng) 磊 包家立* 朱朝陽（浙江中醫(yī)藥大學(xué) 信息技術(shù)學(xué)院，杭州 30053）

2（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部 浙江省生物電磁學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

引言

內(nèi)穩(wěn)態(tài)是生理學(xué)的一個(gè)重要理論，1932年美國生理學(xué)家坎農(nóng)（W.B.Cannon）在出版的《人體的智慧》一書中明確提出了內(nèi)穩(wěn)態(tài)（homeostasis）概念，被認(rèn)為是20世紀(jì)生理學(xué)最重要的理論之一。內(nèi)穩(wěn)態(tài)理論描述了生物體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的自我調(diào)節(jié)過程，揭示了生物體對環(huán)境變化的一種耐受限度，但沒有在數(shù)量上對耐受性加以闡述。內(nèi)穩(wěn)態(tài)的產(chǎn)生機(jī)制是負(fù)反饋，控制論創(chuàng)始人、美國數(shù)學(xué)家維納和生理學(xué)家羅森布呂特認(rèn)為，負(fù)反饋是保持穩(wěn)態(tài)的基本條件，穩(wěn)態(tài)是動態(tài)平衡的結(jié)果［1］。

魯棒性原是統(tǒng)計(jì)學(xué)中的一個(gè)專門術(shù)語，20世紀(jì)70年代初開始在控制理論領(lǐng)域研究，用以表征控制系統(tǒng)對系統(tǒng)特性或參數(shù)攝動的不敏感性。生物體作為一種由多組分、多層次、多尺度組成的高度復(fù)雜的控制系統(tǒng)，具有控制系統(tǒng)的一般共性，其中內(nèi)穩(wěn)態(tài)就是控制理論所闡述的穩(wěn)定性，但生理學(xué)中的內(nèi)穩(wěn)態(tài)分析還缺乏控制理論的方法?？刂评碚摫砻?，魯棒性是一切類型控制系統(tǒng)所必須考慮的一個(gè)基本問題。生物體遭受著外界環(huán)境變化而導(dǎo)致特性改變，因此魯棒性同樣也是生物系統(tǒng)分析中必須考慮的。

1997年，Barkai和Leibler首次報(bào)導(dǎo)了細(xì)菌趨化的生物魯棒性，說明細(xì)菌可以適應(yīng)化學(xué)誘導(dǎo)劑在一個(gè)較寬濃度范圍內(nèi)的變化，并且總是根據(jù)化學(xué)誘導(dǎo)劑濃度的變化來調(diào)節(jié)自身行為，認(rèn)為魯棒性是生物體的基本特性［2-3］。之后，關(guān)于生物魯棒性的研究逐漸增多，總結(jié)起來有幾個(gè)方向：一是以生物網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的魯棒性研究，如生化網(wǎng)絡(luò)［4］、基因網(wǎng)絡(luò)［5］、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)［6］、p53網(wǎng)絡(luò)［7］等；二是以控制理論為基礎(chǔ)的方法學(xué)研究，如定量模型［8］、反饋控制［9-10］、非線性分岔［8，11-13］、魯棒區(qū)域［6，14-16］等；三是以生物物種為基礎(chǔ)的生物個(gè)案研究，如細(xì)菌［2-3，9］、p53基因［7］、盤基網(wǎng)柄菌［4］、體節(jié)極性基因［17］、血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)［18］等。Laub和Loomis提出的趨化盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞cAMP振蕩網(wǎng)絡(luò)模型，是目前方法學(xué)研究中用得較多的一種生物魯棒模型［4，8，13-17］。生物魯棒性對醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為腫瘤治療［19］和糖尿病治療［20］等提供了新思路。

穩(wěn)定是生物維生的基礎(chǔ)，本研究以內(nèi)皮細(xì)胞為對象，用H2O2作為外源擾動劑，研究在外擾作用下細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)魯棒性實(shí)驗(yàn)的技術(shù)路徑，為其他擾動劑（如電磁場）擾動生物系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。研究表明，運(yùn)用控制理論分析生物系統(tǒng)的魯棒性是一種可行的方法。

1 原理

1.1 生物系統(tǒng)的數(shù)學(xué)描述

設(shè)生物系統(tǒng)是一個(gè)開放系統(tǒng)，系統(tǒng)邊界將系統(tǒng)與環(huán)境分割開來，并且系統(tǒng)與環(huán)境通過系統(tǒng)邊界有物質(zhì)、能量、信息的交換，如圖1所示。生物系統(tǒng)運(yùn)行的狀況稱為狀態(tài)，系統(tǒng)的行為通過狀態(tài)的獲取、保持和改變來體現(xiàn)。研究生物系統(tǒng)就是要研究系統(tǒng)所處的狀態(tài)、狀態(tài)可能的變化、不同狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)移等，而生物系統(tǒng)狀態(tài)可以用一組狀態(tài)變量來表示，如生理或生化指標(biāo)。在一個(gè)穩(wěn)定的生物系統(tǒng)中，系統(tǒng)與環(huán)境之間的物質(zhì)、能量、信息交換保持著動態(tài)平衡，其生理行為是內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)外界擾動劑（簡稱擾動劑）改變了環(huán)境，生物系統(tǒng)與環(huán)境之間的物質(zhì)、能量、信息交換就發(fā)生變化，生物系統(tǒng)原有的內(nèi)穩(wěn)態(tài)可能被打破，也就是說生物系統(tǒng)狀態(tài)可能發(fā)生轉(zhuǎn)移。生物系統(tǒng)狀態(tài)是否轉(zhuǎn)移取決于擾動劑的強(qiáng)度，以及生物系統(tǒng)本身對擾動劑的耐受性，這種耐受性就是一種生物的魯棒性。當(dāng)擾動劑強(qiáng)度較大時(shí)，如果生物系統(tǒng)的狀態(tài)不轉(zhuǎn)移，表明系統(tǒng)仍保持穩(wěn)定，可以判定該系統(tǒng)有較大的魯棒性。

圖1 生物系統(tǒng)與環(huán)境交互作用模型Fig.1 Model of interaction between biological system and environment

根據(jù)上述原理，設(shè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣濃度［Ca2+］i為狀態(tài)x，雙氧水濃度［H2O2］為擾動劑量u。內(nèi)皮細(xì)胞所處的內(nèi)鈣狀態(tài)x及其可能的變化可以用動態(tài)非線性微分方程表示，有

式中，f（x，u，t）是x、u和時(shí)間t的非線性函數(shù)。

當(dāng)擾動劑不作用于細(xì)胞系統(tǒng)（u=0）時(shí)，式（1）演變?yōu)闃?biāo)稱系統(tǒng)，有

實(shí)際上，生物系統(tǒng)是一個(gè)時(shí)變系統(tǒng)，系統(tǒng)狀態(tài)x、狀態(tài)變化率以及擾動劑u均隨時(shí)間t變化，式（1）和式（2）中的變量x和u均是t的函數(shù)。

1.2 Lyapunov穩(wěn)定性理論［21］

基于內(nèi)穩(wěn)態(tài)是生物系統(tǒng)與環(huán)境之間物質(zhì)、能量、信息交換動態(tài)平衡的結(jié)果，可以認(rèn)為生物系統(tǒng)是一種動力學(xué)系統(tǒng)，具有動力學(xué)系統(tǒng)的一般特性。Lyapunov穩(wěn)定性理論是描述動力學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定性的理論，可以用來分析細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)定性。設(shè)x=φ（t）是式（1）的解，定義在時(shí)間域（t0，∞）內(nèi)，解初態(tài)為φ（t0）；帶擾初態(tài)為x0=x（t0），對應(yīng)的軌線為x（t，t0，x0）。如果對于足夠小的ε＞0，總有δ＞0，使得只要

1）如果有

則稱解φ（t）是Lyapunov穩(wěn)定的，否則，稱φ（t）是Lyapunov不穩(wěn)定的。

2）如果t→∞，有

則稱解φ（t）是Lyapunov漸近穩(wěn)定的。

Lyapunov穩(wěn)定的物理意義：φ（t）是從解初態(tài)φ（t0）出發(fā)的式（1）解，x（t）是從帶擾初態(tài)x0=x（t0）（擾動的結(jié)果）出發(fā)的解。式（3）表示這兩種初態(tài)偏離小于δ，式（4）表示兩個(gè)解在全過程中每一時(shí)刻t的偏差都小于任意指定的小數(shù)ε。Lyapunov穩(wěn)定意味著只要擾動（初態(tài)偏離）足夠小，系統(tǒng)在時(shí)間域上的行為偏離也會足夠小。初值小的擾動只能引起軌線的小偏離，這樣系統(tǒng)就有能力保存自己并發(fā)揮功能。式（5）表示帶擾初態(tài)x0引起的軌線偏離隨時(shí)間延伸而趨于0，這種穩(wěn)定要求偏差最終完全消除，回到原定態(tài)。

1.3 魯棒性理論［22-23］

考慮式（1）的非線性系統(tǒng)，擾動劑u的施加是依賴于系統(tǒng)狀態(tài)x（t），有

式中，θ［x（t）］稱為標(biāo)稱控制量。

事實(shí)上，擾動劑u包括加性擾動Φ和增益擾動Ψ（Φ和Ψ隨機(jī)），即

為了方便，統(tǒng)一記為

這樣，式（1）的系統(tǒng)在受到擾動劑作用后為

根據(jù)文獻(xiàn)［22］，設(shè)式（1）系統(tǒng)在穩(wěn)態(tài)點(diǎn)的Lyapunov函數(shù)為V（x），則該系統(tǒng)必然存在一個(gè)擾動量集合，即

D=｛u：V（fs（x，t））-V（x）＜0；?x≠0∈Rn，fs（x，t）｝

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)

細(xì)胞為永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系饋贈）。

2.1.1 復(fù)蘇

從-80℃冰箱中取出凍存的內(nèi)皮細(xì)胞，迅速置于37℃水浴鍋并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1min之內(nèi)融化。打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。900r/min離心5min，棄去上清液。沉淀加適當(dāng)培養(yǎng)基胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。

2.1.2 培養(yǎng)

待復(fù)蘇后的內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)瓶是長成致密單層后，吸除瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液。取1mL含EDTA的0.25％胰酶（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）溶液潤洗培養(yǎng)瓶，然后加入3mL胰酶溶液消化。當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，加入含10％胎牛血清的RPMI.1640培養(yǎng)液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）和胰酶。用吸管輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。900r/min離心細(xì)胞懸液，5min后棄去上清液。加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，用吸管將沉淀重新制成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶中，或以1×105cells/皿的密度接種于35mm培養(yǎng)皿中（細(xì)胞復(fù)蘇第3代之后用于實(shí)驗(yàn)），接種24h后用于實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 凍存

用含EDTA的0.25％胰酶溶液消化內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。900r/min離心5min，棄上清液。沉淀加入凍存保護(hù)液（含20％胎牛血清的RPMI.1640培養(yǎng)液+二甲基亞砜DMSO（美國Sigma公司），計(jì)數(shù)，調(diào)整至5×106cells/mL左右。將懸液分至凍存管中，每管1mL。將凍存管口封嚴(yán)，貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期，放入-80℃冰箱中凍存。

2.2 細(xì)胞內(nèi)鈣測定

基礎(chǔ)細(xì)胞外液配制：NaCl（140mmol/L），MgCl2（1mmol/L），CaCl2（1.8mmol/L），HEPES（10mmol/L），葡萄糖（10mmol/L）。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞外液為：在基礎(chǔ)細(xì)胞外液中，加1、10、30、50和100μmol/L五種不同劑量的H2O2作為擾動劑。

培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞用基礎(chǔ)細(xì)胞外液漂洗2～3次，洗掉細(xì)胞表面的殘?jiān)棵蠹?xì)胞加入1mL熒光負(fù)載液（5μmol/LFluo-3/Am（美國Invitrogen公司）），37℃負(fù)載30min，再次用基礎(chǔ)細(xì)胞外液洗滌2～3次，充分洗掉沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光探針，加入1mL基礎(chǔ)細(xì)胞外液，上機(jī)待測。

將負(fù)載好的細(xì)胞放在激光共聚焦顯微鏡（德國Leica）載物臺上，掃描條件為：激發(fā)波長488nm，物鏡20X，掃描速度為快速掃描，掃描密度512×512，掃描模式為時(shí)間序列掃描，掃描間隔時(shí)間Ts=3.6s。這樣，可以獲得細(xì)胞內(nèi)鈣變化的時(shí)序圖，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度用熒光強(qiáng)度Fluo-3表示。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

取6皿細(xì)胞分別用于全局對照皿，1、10、30、50、100μmol/L劑量H2O2擾動實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)在加入擾動劑前，先記錄10min胞內(nèi)鈣熒光用于自身對照。然后，移開顯微鏡頭，加入擾動劑，再記錄50min胞內(nèi)鈣熒光。全局對照，連續(xù)記錄60min。

2.4 細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)圖繪制

根據(jù)文中1.3魯棒性理論，建立細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)圖作為魯棒性分析的基礎(chǔ)。將所獲得的細(xì)胞內(nèi)鈣時(shí)序圖分自身對照期（時(shí)長t=10min）、擾動期（t≤20s）和擾動響應(yīng)期（時(shí)長t=50min）3個(gè)時(shí)段。在采樣時(shí)刻t=0，Ts，2Ts，…，NTs（或采樣點(diǎn)0，1，2，…，N），獲得所對應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)數(shù)據(jù)x（0），x（Ts），x（2Ts），…，x（NTs），組成細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)向量數(shù)據(jù)集為

式中，x（0），x（1），…，x（m）（mTs=10min）為自身對照期數(shù)據(jù)集；x（n），x（n+1），…，x（N）（NTsnTs=50min）為擾動響應(yīng)期數(shù)據(jù)集。x（m+1），…，x（n-1）為擾動期，即移開顯微鏡頭加入擾動劑所需的時(shí)間，其數(shù)據(jù)不參與分析。

這樣，細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)變化率數(shù)據(jù)集為

根據(jù)式（11）和式（12）的數(shù)據(jù)集，以細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)x為橫坐標(biāo)、細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)變化率為縱坐標(biāo)，繪制-x的細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)圖。這樣，式（1）或式（2）系統(tǒng)是一種以x和為變量的二維系統(tǒng)。

2.5 標(biāo)稱系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)點(diǎn)和穩(wěn)定域的實(shí)驗(yàn)確定

根據(jù)式（2），標(biāo)稱系統(tǒng)是指加擾動劑前的細(xì)胞系統(tǒng)。研究細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的前提是：細(xì)胞在遭受外源因素?cái)_動前，標(biāo)稱系統(tǒng)是穩(wěn)定的。用以下方法，對標(biāo)稱系統(tǒng)的穩(wěn)定性作定量判斷。

在自身對照期，取細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)x在所遍歷時(shí)間（0，mTs）內(nèi)的均值xe和方差σ2分別為

式中，xe為穩(wěn)態(tài)點(diǎn)，表征標(biāo)稱系統(tǒng)在遍歷時(shí)間（0，mTs）內(nèi)細(xì)胞內(nèi)鈣所處的穩(wěn)態(tài)。

由于式（2）標(biāo)稱系統(tǒng)是二維系統(tǒng)，根據(jù)Lyapunov穩(wěn)定性和魯棒性理論，其穩(wěn)定點(diǎn)是一種封閉軌道線形成的中心點(diǎn)。該中心點(diǎn)是一個(gè)以（xe，0）為中心，以

為半徑的圓域A，K為置信系數(shù)，且Lyapunov穩(wěn)定。因此，該圓域A即為穩(wěn)定域。

2.6 擾動作用下細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)判斷

在擾動響應(yīng)期（nTs，NTs），細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)x是關(guān)于以帶擾初態(tài)x0=x（t0）=xe為起點(diǎn)，在遍歷時(shí)間（nTs，NTs）內(nèi)對應(yīng)的軌線x（t，t0，xe）。該軌線的每一個(gè)采樣點(diǎn)（x（i），（i））（i=n，n+1，…，N）距離標(biāo)稱系統(tǒng)穩(wěn)定點(diǎn)中心（xe，0）的距離為

如果r’＜r，可以判斷細(xì)胞在遭受擾動劑作用后，內(nèi)鈣狀態(tài)仍保持在穩(wěn)定域A內(nèi)，是Lyapunov穩(wěn)定的。否則，可以判斷細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)移。

2.7 擾動劑穩(wěn)定魯棒域的實(shí)驗(yàn)確定

對6皿細(xì)胞分別編號1～6號，其中1號為全局對照，2～6號分別為1、10、30、50、100μmol/L劑量H2O2擾動。每皿分別選擇8個(gè)細(xì)胞做記錄，每個(gè)細(xì)胞通過自身對照期確定了穩(wěn)態(tài)點(diǎn)（xe，0）和穩(wěn)定域A。擾動響應(yīng)期內(nèi)每一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)鈣狀態(tài)x均為以帶擾初態(tài)x（t0）=xe為起點(diǎn)的一條軌線x（t，t0，xe）。每種劑量的擾動均對應(yīng)8條這種軌線，判斷每條軌線是否處于Lyapunov漸進(jìn)穩(wěn)定。

若軌線x（t，t0，xe）處于Lyapunov穩(wěn)定，表明該擾動劑劑量對該細(xì)胞作用在穩(wěn)定魯棒域D內(nèi)，否則，不在D內(nèi)。若軌線x（t，t0，xe）處于Lyapunov漸進(jìn)穩(wěn)定，表明該劑量的擾動劑對該細(xì)胞作用在穩(wěn)定魯棒域D邊界。這樣，以進(jìn)入Lyapunov漸進(jìn)穩(wěn)定所對應(yīng)的擾動劑劑量確定為穩(wěn)定魯棒域D。

3 結(jié)果與討論

3.1 鈣熒光負(fù)載

內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)熒光探針Fluo-3/AM負(fù)載30min后，進(jìn)行鈣熒光強(qiáng)度測定?？梢姛晒庳?fù)載的背景值低，熒光在細(xì)胞中負(fù)載均勻，胞體清晰可見。同一皿中的細(xì)胞初始熒光強(qiáng)度并不一致，表明對不同細(xì)胞初始胞內(nèi)濃度［Ca2+］i是不相等的。

3.2 標(biāo)稱系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)與穩(wěn)定域

按式（13）～式（16）獲得6皿48個(gè)細(xì)胞在遭受擾動劑作用前，細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)點(diǎn)xe和穩(wěn)定域r如表1所示。這48個(gè)細(xì)胞自然生長條件相同（即來源于同一種源，在同一環(huán)境中培養(yǎng)），然而，細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)點(diǎn)卻從0.709到8.189不等，相差1個(gè)數(shù)量級，表明不同細(xì)胞即使在同一條件下生長，其內(nèi)鈣狀態(tài)有較大的差別，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的個(gè)體差異。另一方面，穩(wěn)定域半徑從0.654到2.650不等分布，相差3倍，表明這48個(gè)細(xì)胞的穩(wěn)定性較好，可以排除后續(xù)擾動實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞不穩(wěn)定對結(jié)果的影響。

根據(jù)控制理論，穩(wěn)定域半徑r是一種歐幾里得范數(shù)（2-范數(shù)），具有齊次性。因此，我們根據(jù)本例實(shí)際設(shè)置式（16）中置信系數(shù)K=2。

3.3 擾動作用下細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)轉(zhuǎn)移

圖2是6個(gè)細(xì)胞皿中其中一個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣的全景時(shí)序圖和相應(yīng)的狀態(tài)圖，一張完整的全景時(shí)序圖有自身對照期（0～mTs）、擾動期（（m+1）Ts～（n-1）Ts）和擾動響應(yīng)期（nTs～NTs）3個(gè)時(shí)期。從時(shí)序圖中可見：當(dāng)按2.3實(shí)驗(yàn)方法移開鏡頭加擾動劑期間，細(xì)胞熒光為0，對應(yīng)的狀態(tài)圖回到了原點(diǎn)。

表1 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)與魯棒性Tab.1 Inner calcium homeostasis and robustness domain of H2O2on endothelial cells

用式（17）可以判斷2～6號細(xì)胞皿中共40個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定狀態(tài)如表1所示。結(jié)果表明：1μmol/L擾動劑擾動內(nèi)皮細(xì)胞，在8個(gè)細(xì)胞中，4個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)穩(wěn)定，4個(gè)漸近穩(wěn)定，表明1μmol/L擾動劑不足以引起細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)的變化。10μmol/L擾動劑擾動，8個(gè)細(xì)胞中，有3個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)穩(wěn)定，2個(gè)漸近穩(wěn)定，3個(gè)不穩(wěn)定，表明10μmol/L已經(jīng)可以擾動使一些細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)不穩(wěn)定。30μmol/L擾動劑擾動，8個(gè)細(xì)胞中，只有1個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)穩(wěn)定，1個(gè)漸近穩(wěn)定，6個(gè)不穩(wěn)定，表明30μmol/L已經(jīng)使多數(shù)細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)不穩(wěn)定。50和100μmol/L擾動，全部細(xì)胞狀態(tài)均不穩(wěn)定，表明這兩個(gè)劑量的擾動劑已經(jīng)足以使細(xì)胞內(nèi)鈣狀態(tài)轉(zhuǎn)移。

表1結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)鈣初態(tài)x0=xe較小或較大的細(xì)胞受擾動后內(nèi)鈣狀態(tài)有的穩(wěn)定或漸進(jìn)穩(wěn)定，有的不穩(wěn)定。表明初態(tài)x0=xe對細(xì)胞受擾后狀態(tài)穩(wěn)定性影響不大。

3.4 擾動劑的穩(wěn)定魯棒域

圖2 細(xì)胞內(nèi)鈣的全景時(shí)序圖（左）及其狀態(tài)圖（右）：（a）對照；（b）1μmol/L；（c）10μmol/L；（d）30μmol/L；（e）50μmol/L；（f）100μmol/L。Fig.2 Whole time sequence（left）and state-chart（right）of inner calcium on the endothelial cells，（a）control；（b）1μmol/L；（c）10μmol/L；（d）30μmol/L；（e）50μmol/L；（f）100μmol/L。

從表1可見，1μmol/L的擾動劑可以使4個(gè)細(xì)胞發(fā)生漸進(jìn)穩(wěn)定，表明1μmol/L擾動劑是這4個(gè)細(xì)胞可能的魯棒域。10μmol/L擾動劑可以使2個(gè)細(xì)胞漸近穩(wěn)定，表明10μmol/L擾動劑是這2個(gè)細(xì)胞可能的魯棒域。30μmol/L擾動劑可以使1個(gè)細(xì)胞漸近穩(wěn)定，表明30μmol/L擾動劑是這個(gè)細(xì)胞可能的魯棒域。從而可得，穩(wěn)定魯棒域D與細(xì)胞個(gè)體有關(guān)，并且不同細(xì)胞個(gè)體所對應(yīng)的D差別較大，進(jìn)一步表明個(gè)體差異對穩(wěn)定魯棒域D的影響。

另一方面，對內(nèi)皮細(xì)胞群體來說，超過50μmol/L的擾動劑均不能使細(xì)胞狀態(tài)回到標(biāo)稱系統(tǒng)的穩(wěn)定點(diǎn)，這表明內(nèi)皮細(xì)胞種族的內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)魯棒域D至少在50μmol/L以內(nèi)。因此，實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)皮細(xì)胞種族的穩(wěn)態(tài)魯棒域D至少在50μmol/L以內(nèi)，但個(gè)體的穩(wěn)態(tài)魯棒域D需因個(gè)體而定。

4 結(jié)論

通過以用H2O2擾動內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)為例，證明利用控制理論的結(jié)論設(shè)計(jì)生物魯棒性實(shí)驗(yàn)，以及用Lyapunov穩(wěn)定性理論和魯棒性理論實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)定量化分析是一種有效的方法。

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