藺慕會， 徐忠信， 陳曉虹

β淀粉樣蛋白(amyloid protein，Aβ)導(dǎo)致的tau蛋白異常磷酸化、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)元凋亡被認(rèn)為是導(dǎo)致阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要原因［1］。有研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞可在AD的發(fā)生發(fā)展中清除Aβ，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，但也有研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞可通過炎癥反應(yīng)加重神經(jīng)元損傷。本研究將預(yù)先被Aβ寡聚體處理的BV2細(xì)胞與PC12通過篩網(wǎng)共育，部分模擬體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元關(guān)系，來探討小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞購于中國科學(xué)院北京細(xì)胞生物研究所，BV2細(xì)胞購于上海復(fù)祥生物科技有限公司。細(xì)胞轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)購于美國BD Falcon公司;1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于GIBCO公司;Aβ1-42，HFIP(六氟丙醇)，抗 tau，tau(pS396)一抗、二抗購于sigma公司;BCA蛋白定量試劑盒購于美國PIERCE公司;Western blot化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于武漢博士德公司;MTT(噻唑藍(lán))購于上海華舜生物工程有限公司;雙染凋亡試劑盒購于上海寶賽公司。

1.2 方法

1.2.1 Aβ 寡聚體的制備及細(xì)胞培養(yǎng) 按Klein WL(2002)方法制備 Aβ1 ～42 寡聚體［2］，用1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100g/L鏈霉素)將PC12細(xì)胞培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中。用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)將BV2細(xì)胞培養(yǎng)在轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)上。在BV2細(xì)胞經(jīng)Aβ1-42處理24h后，將培養(yǎng)液及生長有BV2細(xì)胞的轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)同時移入PC12細(xì)胞培養(yǎng)板與PC12細(xì)胞共育。

1.2.2 分組 在PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入0、1、5、10μmol/L Aβ1-42 處理24h 作為對照組即Aβ+PC12;實(shí)驗(yàn)組則在BV2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0、1、5、10μmol/L Aβ1-42 預(yù)處理24h，然后通過轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)將Aβ1-42處理過的BV2細(xì)胞及培養(yǎng)液移入未處理過的PC12細(xì)胞培養(yǎng)孔共育24h，即Aβ+BV2+PC12。

1.2.3 MTT方法檢測 PC12細(xì)胞抑制率 棄去 PC12 上清，加入 MTT(0.5mg/ml)，37℃孵育 4h，細(xì)胞內(nèi)見到藍(lán)色沉淀后，吸出培養(yǎng)上清液，每孔加入200μl DMSO，使結(jié)晶物充分溶解，空白孔調(diào)零，經(jīng)全自動酶標(biāo)儀于490nm處測定各孔數(shù)值(655nm作為參考波長)。細(xì)胞抑制率計(jì)算:1－(OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，PBS洗3遍，1000r/min離心10min，細(xì)胞沉淀中加入70%乙醇2ml，－20℃固定過夜，1000r/min離心10min，細(xì)胞沉淀中加入PI染色液1ml，流式細(xì)胞儀檢測，用Cell Quest3.0軟件分析。

1.2.5 Western blot方法檢測 tau、tau(pS396)蛋白表達(dá) 將蛋白裂解緩沖液(預(yù)冷至0℃)加入經(jīng)過漂洗的單層PC12細(xì)胞中，靜置20min;收集細(xì)胞，用蛋白定量分析(bicinchonic acid assay BCA法)測定總蛋白濃度。加樣蛋白含量50μg，經(jīng)10%SDSPAGE電泳分離，4℃條件下轉(zhuǎn)膜，置膜于5%脫脂奶粉封閉1h，在室溫下分別加入兔抗大鼠 tau(pS396);tau一抗(1∶1000)，4℃ 過夜，室溫下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶4000)，60min。化學(xué)發(fā)光顯色，計(jì)算機(jī)掃描分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 χ±SD表示，采用統(tǒng)計(jì)程序軟件SPSS10.0 for windows，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測PC12細(xì)胞抑制率 除空白對照外(0μmol/L Aβ1-42)，所有濃度的 ADDLs均可導(dǎo)致PC12細(xì)胞抑制，且PC12細(xì)胞抑制表現(xiàn)為ADDL濃度依賴性關(guān)系，即隨著Aβ濃度增加PC12抑制率也明顯增加，10μmol/L組最明顯，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其中實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞抑制率增加更明顯，10μmol/L組最明顯，并且與對照組中相同濃度組比較，PC12細(xì)胞抑制率增加更明顯，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 MTT檢測PC12細(xì)胞抑制率酶標(biāo)儀檢測結(jié)果(OD值)

2.2 流式細(xì)胞儀分析PC12細(xì)胞凋亡率結(jié)果對照組與實(shí)驗(yàn)組中空白對照組均為少量PC12細(xì)胞凋亡，兩組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)Aβ濃度為1、5、10μmol/L時，對照組與實(shí)驗(yàn)組中均可見PC12細(xì)胞凋亡增多(P＜0.05)，并呈濃度依賴性升高;Aβ濃度相同時兩組比較，實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增多，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖1、圖2)。

2.3 PC12細(xì)胞tau(pS396)、tau蛋白表達(dá)情況各組PC12細(xì)胞tau蛋白表達(dá)無明顯差別，對照組中 Aβ(1、5、10μmol/L)組 tau(pS396)表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);實(shí)驗(yàn)組 Aβ(1、5、10μmol/L)組中PC12細(xì)胞tau(pS396)表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組與對照組相同Aβ濃度組相比PC12細(xì)胞tau(pS396)表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

3 討論

目前認(rèn)為AD是一種由于基因缺陷直接或間接改變淀粉樣蛋白前體(APP)表達(dá)或蛋白酶解過程從而影響Aβ聚集穩(wěn)定性的病理綜合征。Aβ導(dǎo)致的tau蛋白異常磷酸化，神經(jīng)遞質(zhì)丟失，神經(jīng)膠質(zhì)增生和炎癥反應(yīng)等，最終可導(dǎo)致神經(jīng)元功能失調(diào)，死亡。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)重要的免疫細(xì)胞之一，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括 AD［3～5］。但小膠質(zhì)細(xì)胞在AD發(fā)生發(fā)展中的作用是清除Aβ保護(hù)神經(jīng)元，還是通過炎癥反應(yīng)加重神經(jīng)元損傷尚有爭議。本研究通過PC12細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡檢測及Tau蛋白表達(dá)變化的分析，觀察了BV2細(xì)胞被Aβ寡聚體處理后對PC12細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而探討了小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元損傷中的作用。

圖1 Aβ(5μmol/L)對照組PC12細(xì)胞凋亡

圖2 Aβ(5μmol/L)實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞凋亡

圖3 PC12細(xì)胞tau(pS396)、tau蛋白表達(dá)

有研究發(fā)現(xiàn)來源于AD患者腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞對培養(yǎng)皿底部預(yù)先聚集的Aβ沉積物有明顯趨向性，3w內(nèi)Aβ沉積物被小膠質(zhì)細(xì)胞覆蓋。在動物實(shí)驗(yàn)及尸檢也證實(shí)AD患者及動物模型中小膠質(zhì)細(xì)胞能聚集于老年斑周圍并內(nèi)吞Aβ。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)裝載Aβ的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移到血管或腦室旁試圖清除腦內(nèi)Aβ。即小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ具有趨化作用和吞噬性。關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞是吞噬、清除Aβ阻止AD發(fā)展，還是在Aβ作用下分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)加速AD發(fā)展，目前仍存在爭議。

本研究選擇與神經(jīng)元有很多相似之處的PC12細(xì)胞及已被廣泛用來體外培養(yǎng)、代替小膠質(zhì)細(xì)胞的BV2細(xì)胞［6］通過細(xì)胞篩網(wǎng)共同培養(yǎng)，進(jìn)而觀察被Aβ寡聚體預(yù)處理的BV2細(xì)胞對PC12細(xì)胞凋亡的影響。PC12細(xì)胞來自鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系，BV2細(xì)胞來源于鼠小膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞。篩網(wǎng)孔徑8μm，允許篩網(wǎng)內(nèi)外的大分子蛋白和液體交流及細(xì)胞突觸通過，不允許細(xì)胞通過。該模型可分別對PC12細(xì)胞及BV2細(xì)胞的形態(tài)、蛋白質(zhì)、RNA等進(jìn)行檢測，是較理想的模型。結(jié)果表明，所有濃度的ADDLs均可導(dǎo)致PC12細(xì)胞凋亡，且PC12細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為ADDL濃度依賴性關(guān)系，即隨著Aβ濃度增加PC12抑制率、細(xì)胞凋亡、tau(pS396)表達(dá)也明顯增加，其中用Aβ寡聚體預(yù)處理BV2細(xì)胞24h后再與PC12細(xì)胞共育，與Aβ寡聚體直接處理的PC12細(xì)胞組相比，前者PC12細(xì)胞上述指標(biāo)增加更明顯，對照組與實(shí)驗(yàn)組中空白對照組未見明顯的PC12細(xì)胞凋亡。提示BV2細(xì)胞能放大β淀粉樣蛋白對PC12細(xì)胞的損傷，加速tau蛋白異常磷酸化，增加神經(jīng)元凋亡，但“靜止?fàn)顟B(tài)”下的小膠質(zhì)細(xì)胞(Aβ寡聚體0μmol/)無神經(jīng)元損傷作用。支持在病理狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元損傷中起促進(jìn)作用，因此可能加重AD的病情。但本研究應(yīng)用的PC12細(xì)胞及BV2細(xì)胞不是原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞，并且僅此二細(xì)胞共育，并不能完全模仿體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境如血液、腦脊液、其他細(xì)胞成分的影響等，因此有一定的局限性。本研究結(jié)果提示，小膠質(zhì)細(xì)胞在一定條件下可促進(jìn)神經(jīng)元損傷。因此，進(jìn)一步探討小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元損傷中的作用機(jī)制，對于揭示AD發(fā)病機(jī)制以及為AD的臨床治療提供理論依據(jù)將具有重要的意義。

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