馬艷平,劉振興,郝 樂(lè),林 敏,孟 軒,柯 浩

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州,510640)

核酸擴(kuò)增是生命科學(xué)領(lǐng)域的常用研究工具,自 20世紀(jì) 80年代聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)問(wèn)世以來(lái)[1],再到以后出現(xiàn)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、再生式序列復(fù)制和鏈置換擴(kuò)增技術(shù)等以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)診斷和傳染性疾病的檢測(cè)得到了廣泛應(yīng)用[2]。但由于核酸的檢測(cè)需要昂貴的儀器設(shè)備,存在特異性不高、操作程序復(fù)雜等特點(diǎn),大大限制了作為快速診斷方法的應(yīng)用。2000年Notomi等開(kāi)發(fā)了一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法,即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(1oop-mediated isothermal amp lification,LAMP)。其特點(diǎn)是在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列[3],使其作為快速診斷成為可能。它是針對(duì)靶基因的 6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì) 4種特異引物,利用一種鏈置換 DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在等溫條件(約 65℃)保溫幾十分鐘,即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過(guò)程?；虻臄U(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成,擴(kuò)增效率高,可在 15～60m in擴(kuò)增 109～1010倍[4]。所有靶基因序列的檢測(cè)可只通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判別。該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等方面的檢測(cè)。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理

1.1 引物設(shè)計(jì)

針對(duì)靶基因 6個(gè)特異序列(3′端的 F3c,F2c,F1c區(qū)以及 5′端的 Bl,B2,B 3區(qū))設(shè)計(jì) 4條引物,即上游內(nèi)部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游內(nèi)部引物(BIP)、下游外部引物(B3)[5]。后來(lái)添加了 2條環(huán)狀引物,上游環(huán)狀引物(LF)和下游環(huán)狀引物(LB)。

1.2 擴(kuò)增程序

60～65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度,是一種動(dòng)態(tài)活性溫度。因此,DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物,依靠一種高活性鏈置換 DNA聚合酶,使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。LAMP反應(yīng)過(guò)程是先由外部引物擴(kuò)增出內(nèi)部引物擴(kuò)增所需要的模板,即起始反應(yīng)物模板的合成;緊接著由內(nèi)部引物引導(dǎo)合成靶基因 DNA片段,由于內(nèi)部引物擴(kuò)增的 DNA片段含有與該引物 5′端 DNA片段的反向互補(bǔ)序列,因而這些反向互補(bǔ)序列之間通過(guò)雜交形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),另外一條內(nèi)部引物與其互補(bǔ)鏈退火雜交后引導(dǎo)鏈置換合成反應(yīng),在擴(kuò)增的DNA片段的另外一端產(chǎn)生了新的莖環(huán)結(jié)構(gòu),形成啞鈴結(jié)構(gòu),如此往復(fù)循環(huán)最后形成菜花樣結(jié)構(gòu)[6]。LAMP的整個(gè)反應(yīng)分三步完成,即起初反應(yīng)物模板的合成,循環(huán)擴(kuò)增階段,延伸和再循環(huán)。

1.3 結(jié)果鑒定

1.3.1 電泳檢測(cè) LAMP的產(chǎn)物可以用瓊脂糖凝膠電泳,紫外線(xiàn)燈下觀察。由于產(chǎn)物是混合物,故呈現(xiàn)出特異的梯狀條帶,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切之后呈現(xiàn)單一靶序列條帶。

1.3.2 熒光檢測(cè) 在 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green I熒光染料,只與雙鏈DNA小溝結(jié)合,當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí),肉眼觀察熒光染料由橘黃色變?yōu)榫G色,紫外線(xiàn)下可以發(fā)出熒光[7],而陰性對(duì)照管顏色沒(méi)有發(fā)生變化。在一個(gè)體系內(nèi)其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量,熒光強(qiáng)度檢測(cè)可以用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行。

1.3.3 濁度檢測(cè) 在核酸大量合成時(shí),從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg結(jié)合。產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀。其具有極高的特異性。只要用肉眼觀察或濁度儀在 400 nm光下檢測(cè)濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否,并對(duì)起始模板定量,達(dá)到實(shí)時(shí)定量的檢測(cè),是最常用最便捷的檢測(cè)方法[8]。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特性

LAMP具有許多迄今為止的擴(kuò)增方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。

2.1 高特異性

LAMP應(yīng)用 6個(gè)區(qū)段、4種引物,并且這 6個(gè)區(qū)段的順序也有規(guī)定。原理上LAMP擴(kuò)增的特異性很高,因此可以根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否,即能夠進(jìn)行細(xì)菌或病毒的定性檢測(cè)。

2.2 快速、高效擴(kuò)增

整個(gè)擴(kuò)增在 30～60min即可完成,且產(chǎn)率可達(dá)到 0.15 g/L。若在引物上再進(jìn)一步改進(jìn),可大大提高其擴(kuò)增效率,擴(kuò)增時(shí)間在原來(lái)的基礎(chǔ)上減少1/3～1/2[9]。

2.3 高靈敏度

擴(kuò)增模板可達(dá) 10拷貝或更少。能從極低微量的拷貝中擴(kuò)增出目的基因,擴(kuò)增效率可高達(dá) 109～1010拷貝。比傳統(tǒng)PCR高出 2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.4 步驟簡(jiǎn)單

與傳統(tǒng) PCR技術(shù)相比,LAMP技術(shù)簡(jiǎn)化了94℃變性步驟,同時(shí)退火和延伸在等溫條件下進(jìn)行。且LAMP不需要特殊試劑,不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性[10]。另外,對(duì)RNA病毒不需要單獨(dú)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),只要在DNA基因擴(kuò)增試劑的基礎(chǔ)上加上逆轉(zhuǎn)錄酶,就能夠完全像DNA基因擴(kuò)增那樣,一步實(shí)現(xiàn)RNA擴(kuò)增。

2.5 結(jié)果易于鑒定

在核酸大量合成時(shí),從dNTP析出焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀。它有極高的特異性,只要用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)沉淀濁度就能判斷擴(kuò)增與否。

LAMP方法有其自身方法上的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)又有其無(wú)法逾越的障礙,它只能有擴(kuò)增和不擴(kuò)增 2種結(jié)果,靶序列長(zhǎng)度控制在 300 bp以下,一旦產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,則不易鑒別,這些都無(wú)法同 PCR相比[11]。并且該方法由于采用多條引物,在同一溫度下擴(kuò)增,引物之間有可能互補(bǔ)而擴(kuò)增出非特異性條帶,容易造成假陽(yáng)性。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已被用于對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)的檢測(cè)、動(dòng)物胚胎性別鑒定等領(lǐng)域,在疾病的快速檢測(cè)方面發(fā)展迅速,可對(duì)多種疾病進(jìn)行檢測(cè)和鑒定,是最有發(fā)展前景的快速診斷手段的方法之一。

3.1 病毒檢測(cè)的應(yīng)用

目前應(yīng)用 LAMP技術(shù)檢測(cè)的病毒主要有乙肝肝炎病毒、流感病毒、單純皰疹病毒、水痘—帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、西尼羅河病毒等。

3.1.1 DNA病毒 Kaneko等[12]利用 LAMP檢測(cè)單純皰疹病毒(HSV)-l和 HSV-2及水痘—帶狀皰疹病毒(VZV)-1。Enomoto等[13]用 LAMP和PCR以及病毒分離法擴(kuò)增單純皰疹病毒(HSV)DNA,用LAMP分析法,在 50例樣品中測(cè)出 10例 HSV-1陽(yáng)性和 13例 HSV-2陽(yáng)性;若采用 PCR分析法,則可測(cè)出 12例 HSV-1陽(yáng)性和 18例 HSV-2陽(yáng)性樣品;若采用病毒分離法則可測(cè)出 10例 HSV-1陽(yáng)性,12例 HSV-2陽(yáng)性,并且沒(méi)有1例表現(xiàn)為雙陽(yáng)性。由結(jié)果看,盡管對(duì)于實(shí)時(shí) PCR分析法來(lái)說(shuō),LAMP的靈敏性是較低的,但若以病毒分離法作為比較的標(biāo)準(zhǔn),LAMP是具有高靈敏性和高特異性的,符合臨床使用的標(biāo)準(zhǔn)。

3.1.2 RNA病毒 Notom i T等[14]首先將LAMP與反轉(zhuǎn)錄相結(jié)合建立了 RT-LAMP技術(shù),是反轉(zhuǎn)錄和等溫?cái)U(kuò)增在同一反應(yīng)管中進(jìn)行。現(xiàn)已有許多報(bào)道 RT-LAMP技術(shù)用于RNA病毒的檢測(cè)。如Parida等[15]用實(shí)時(shí)RT-LAMP檢測(cè)西尼羅病毒包膜蛋白基因,敏感度是 RT-PCR的 l0倍,可檢測(cè) 0.1 PFU病毒。Hong等[16]用 LAMP方法檢測(cè) SARS病毒,與傳統(tǒng) RTPCR方法相比,敏感性高 100倍,能檢測(cè)出 0.0l PFU的病毒,敏感性和特異性分別是 RT-PCR法的 100%和 87%。Dukes等[17]用 RT-LAMP檢測(cè)口蹄疫病毒(FMDV),能在 22min內(nèi)檢測(cè)出 10個(gè)拷貝的口蹄疫病毒。

3.2 細(xì)菌檢測(cè)

目前應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的檢測(cè)主要有結(jié)核分支桿菌、痢疾志賀菌、大腸桿菌、螺旋體、肺炎鏈球菌和耶氏菌等。

Iwamoto等[18]根據(jù)gyrB基因序列針對(duì)結(jié)核分支桿菌、鳥(niǎo)分支桿菌和胞內(nèi)分支桿菌的特異引物和 16SrRNA保守序列的分支桿菌屬公共引物,用LAMP方法從痰標(biāo)本中鑒定結(jié)核分支桿菌、鳥(niǎo)分支桿菌和胞內(nèi)分支桿菌。其操作非常簡(jiǎn)單,僅將所有的反應(yīng)物混合后 63℃孵育,即可在反應(yīng)試管中加入SYBR GreenⅠ進(jìn)行檢測(cè)。如果含有擴(kuò)增產(chǎn)物,反應(yīng)混合物變綠;反之,則保持 SYBR GreenⅠ的橙色不變。LAMP從固體培養(yǎng)基中鑒定出特異的分支桿菌屬所用時(shí)間為 35min以?xún)?nèi),而液體培養(yǎng)基則需 60min。

3.3 寄生蟲(chóng)檢測(cè)

2003年 Kuboki等[19]用 LAMP成功地對(duì)非洲錐蟲(chóng)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增后,于 2005年又用 LAMP,PCR以及寄生蟲(chóng)學(xué)方法(血涂片、鼠接種實(shí)驗(yàn))對(duì)實(shí)驗(yàn)感染豬體內(nèi)的埃文斯錐蟲(chóng)進(jìn)行了檢測(cè),并對(duì)其方法進(jìn)行了評(píng)價(jià),認(rèn)為L(zhǎng)AMP技術(shù)在檢測(cè)錐蟲(chóng)感染上與 PCR和寄生蟲(chóng)學(xué)方法同樣敏感[20]。

3.4 胚胎性別鑒定

運(yùn)用 LAMP方法進(jìn)行早期胚胎性別鑒定具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)?；?Y染色體上特異序列的檢測(cè),可判別胚胎性別。日本株式會(huì)社[21]利用 LAMP檢測(cè)牛早期胚胎的性別,顯微切割胚胎提取 DNA,其性別鑒定準(zhǔn)確率達(dá)88.9%～94.4%,切割后的胚胎移植妊娠率高,總時(shí)間在 1 h內(nèi)即可完成,適用于在養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行操作。

3.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與其它技術(shù)相結(jié)合的應(yīng)用

熒光原位雜交、原位PCR、原位RT-PCR的出現(xiàn)使得擴(kuò)增與原位雜交相結(jié)合,極大地提高了靈敏度,但存在熱循環(huán)細(xì)胞破壞和擴(kuò)增產(chǎn)物泄露造成的高背景問(wèn)題,原位LAMP技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。2003年 Maruyama等[22]用LAMP方法和原位雜交技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)大腸桿菌O157∶H 7的 stx2基因與原位PCR比較,并采用熒光抗體標(biāo)記來(lái)驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)原位PCR而言,溫和的滲透性及低等溫條件使得原位LAMP引起較少的細(xì)胞損傷,準(zhǔn)確性更高。Fukuta等[23]用建立的免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄LAMP對(duì)感染番茄的菊花斑點(diǎn)枯萎病毒進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明,該方法的敏感性是免疫反轉(zhuǎn)錄PCR的 100倍。

4 展 望

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是本世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)技術(shù)。雖然還存在諸多的缺點(diǎn)和不足,但它在不斷地改進(jìn)和完善,在研究病原體快速檢測(cè)方面有廣闊的前景。鑒于LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),有可能將來(lái)建立起成本低廉的檢測(cè)體系。LAMP作為一種核酸擴(kuò)增的快速檢測(cè)方法,將會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)