劉曉賀,韓文瑜

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春,130062)

布魯菌病(Brucellosis)是由布魯菌(Brucella)引起的主要侵害生殖系統(tǒng)的一種全世界廣泛分布的人畜共患慢性細(xì)菌傳染病。該病屬自然疫源性傳染病,在全世界各地都有很廣泛的分布[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為多種動(dòng)物共患病,中國將其列為二類動(dòng)物疫病。世界范圍內(nèi)每年出現(xiàn)約 50萬例人間布魯菌病病例,因此加強(qiáng)布魯菌病的研究和綜合防控具有重要意義[2]。

1 布魯菌病的概況

1.1 病原學(xué)特征

布魯菌有 6個(gè)種(Species),20個(gè)生物型(Biotype),包括羊布魯菌氏(melitensis)3個(gè)生物型;牛布魯菌(Brucella abortus)9個(gè)生物型;豬布魯菌(Brucella suis)5個(gè)生物型;沙林鼠布魯菌氏(Brucellaneotomae)1個(gè)生物型;綿羊附睪布魯菌(Brucellaovis)和犬布魯菌(Brucella Caris)各有 1個(gè)生物型[3]。布魯菌不產(chǎn)生外毒素,但有毒性較強(qiáng)的內(nèi)毒素,其中以羊布魯菌內(nèi)毒素毒力最強(qiáng),因此內(nèi)毒素是布魯菌的主要致病因素。不同種的布魯菌其致病力也不同。一般認(rèn)為羊布魯菌的致病力最強(qiáng),豬布魯菌毒力次之,牛布魯菌毒力最弱。

1.2 流行病學(xué)特點(diǎn)

在自然條件下,布魯菌病主要在人和家畜(主要是羊、牛、豬)中廣泛分布,某些鳥類、昆蟲、爬蟲類、兩棲類和魚類等動(dòng)物也可攜帶布魯菌。其中綿羊和山羊往往是布魯菌病流行的主要傳染源。

家畜和野生動(dòng)物都可通過采食污染奶或接觸污染新生兒組織或液體而感染。這些動(dòng)物又可作為動(dòng)物源性食品添加而再次引發(fā)該病。為此全世界很多農(nóng)業(yè)組織很關(guān)注該病[4]。發(fā)達(dá)國家通過疫苗接種、監(jiān)督和檢疫等措施有效控制了食用動(dòng)物中布病的傳播。感染人通常是由于接觸感染動(dòng)物或飲用未消毒的奶制品,沒有關(guān)于人與人之間直接傳播的報(bào)道。然而,人可因吸入被污染的塵?；驓馊苣z而感染。所以布魯菌是全世界很多實(shí)驗(yàn)室共同的獲得性感染的病原菌。

2 布魯菌病的診斷方法

診斷技術(shù)一直是布病研究的重要領(lǐng)域[5]。在 20世紀(jì)末的 80～90年代,由于分子生物學(xué)的飛速發(fā)展,有力地推動(dòng)了包括布病在內(nèi)的疫病診斷技術(shù)發(fā)展。

2.1 病原學(xué)診斷

布魯菌的病原學(xué)診斷除通過病料直接涂片染色鏡檢外,已有用過氧化物酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記的特異性免疫染色檢驗(yàn)技術(shù)[6]。DNA探針和PCR技術(shù)已經(jīng)成為病原診斷的實(shí)用方法,有一種叫做野外脈沖凝膠電泳的技術(shù)用于布病原鑒定,這種技術(shù)可以鑒別布魯菌各個(gè)種。

準(zhǔn)確的診斷對布病防控有著及其重要的作用,當(dāng)今PCR診斷技術(shù)主要有 3類:(1)用于群體試驗(yàn)鑒定感染群;(2)確認(rèn)感染群中的感染動(dòng)物及其病原的種,以便采取合適的防控措施;(3)確定流行病學(xué)狀態(tài)以幫助流行病專家追蹤傳染源。

唐瀏英等[7]開始將 PCR技術(shù)應(yīng)用于布魯菌的檢測,針對牛布魯菌氏桿菌 36 ku OMP基因設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增 180 bp產(chǎn)物是 6個(gè)種間的同源性很高的保守序列,檢測結(jié)果證明具有良好的特異性和敏感性。李蘭玉等針對牛布魯氏桿菌 31 ku OMP基因設(shè)計(jì)引物,試驗(yàn)結(jié)果表明其特異性和敏感性也較好。王勝昌等[8]利用編碼 31 ku布魯氏桿菌蛋白(BCSP31)的基因設(shè)計(jì)兩對特異性的引物,對布魯氏桿菌 R型、S型抗原,及其他不同病原菌分別進(jìn)行內(nèi)、外引物 PCR反應(yīng)及套式 PCR反應(yīng),試驗(yàn)證明此 PCR方法具有特異性強(qiáng),敏感性高的特點(diǎn),尚未進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用評測。有學(xué)者認(rèn)為 PCR技術(shù)還不穩(wěn)定,尚不能作為確診依據(jù),應(yīng)結(jié)合其他檢查判定結(jié)果。

2.2 血清學(xué)診斷

2.2.1 傳統(tǒng)試驗(yàn) 傳統(tǒng)方法的凝集試驗(yàn)(包括試管凝集試驗(yàn)、平板凝集試驗(yàn))在發(fā)達(dá)國家已基本上停止使用,取代的方法是緩沖布魯菌抗原試驗(yàn),包括卡片試驗(yàn)、虎紅平板凝集試驗(yàn)、緩沖平板凝集試驗(yàn)。在國際貿(mào)易中,緩沖布魯菌抗原試驗(yàn)是牛、羊、豬種布病診斷的指定試驗(yàn),作為篩選試驗(yàn)用。

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)至今仍是布病的重要診斷方法,是牛、羊及綿羊副睪種布病診斷的國際貿(mào)易指定試驗(yàn),作為確診試驗(yàn)用。乳環(huán)試(MRT)依然是奶牛布病監(jiān)測的主要方法。

2.2.2 ELISA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是一種與 CFT效果相當(dāng)?shù)脑囼?yàn),操作更方便,既可以作為確定試驗(yàn),又可以作為篩選試驗(yàn)。但只有用于牛種布病的 ELISA是國際貿(mào)易指定試驗(yàn)。這種 ELISA方法不但用于血清學(xué)診斷,還可用于乳汁檢查。其它種布病上的應(yīng)用還需進(jìn)一步改進(jìn)抗原和積累數(shù)據(jù)。

關(guān)于 ELISA的研究報(bào)道相當(dāng)多:谷登峰等[9]建立了一種 Do t-EL ISA和單克隆抗體相結(jié)合的檢測方法,該試驗(yàn)證明該方法具有特異、敏感、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。魯齊發(fā)等[10]在制備布魯菌抗原辣根過氧化物酶結(jié)合物基礎(chǔ)上,建立了雙抗原夾心法酶免疫試驗(yàn)DA gS-ELISA及 DA gS-DIEA,并與間接ELISA、試管凝集試驗(yàn)及虎紅平板凝集試驗(yàn)對部分布魯菌病患者、可疑患者、布魯菌感染羊只以及布魯菌感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清標(biāo)本進(jìn)行了檢測比較。結(jié)果表明,陽性率以 DA gSELISA最高(60.0%～62.9%)。張俊琴等[11]對此方法的實(shí)用效果進(jìn)行了進(jìn)一步的評價(jià),表明 DA gS-ELISA對亞急性、慢性病人的靈敏度、符合率、卡帕值均較高,并且用聚乙烯材料做包被板比聚苯乙烯要更經(jīng)濟(jì)且診斷價(jià)值更高,ELISA的效果關(guān)鍵在于抗原的選用。在已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化了的牛仔布病ELISA診斷中使用了 S-LPS抗原。另外,從牛種布魯菌和羊種布魯菌獲得的能表達(dá)高度免疫原性蛋白的基因,可生產(chǎn)用于鑒別 S19和Rev.1疫苗免疫與自然感染的蛋白。

3 布病分子生物學(xué)

Galdiero E等[12]完成羊布魯菌 M16株全基因組測序工作,基因注釋尚未完成。目前主要研究的保護(hù)性抗原為外膜蛋白(Omp)、核蛋白 L7/L12、胞質(zhì)結(jié)合蛋白 P39等。Omp 25和 Omp31是研究最多的兩種布魯菌外膜蛋白。此外,還有Omp 36蛋白是一類構(gòu)成跨膜通道的膜孔蛋白,在羊種布魯菌中含量較少,具有良好的免疫原性。核蛋白 L7/L12由Rp1L基因表達(dá),在布魯菌各菌株間具有高度的保守性,是重要的優(yōu)勢抗原。以核蛋白L7/L12為基礎(chǔ)構(gòu)建的疫苗對感染具有顯著的抵抗作用。最近研究結(jié)果表明[13],牛布魯菌的翻譯延伸因子3(IF3)具有很強(qiáng)的免疫保護(hù)作用,其大腸桿菌表達(dá)的 IF3重組蛋白可體外刺激淋巴細(xì)胞增殖,該蛋白是很有前景的布魯菌亞單位苗的候選抗原。布魯菌的特征之一是不表達(dá)與其他病原微生物相似的經(jīng)典的毒力因子。迄今為止,對布魯菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)的生存與繁殖機(jī)制,以及它與宿主的相互作用關(guān)系所知甚少。布魯菌在細(xì)胞內(nèi)生存的分子特征也是布病防控研究的關(guān)鍵。布病分子生物學(xué)研究工作的一個(gè)重要方面就是研究宿主響應(yīng)布魯菌感染差異表達(dá)的功能基因。

目前研究布魯菌感染宿主細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化,主要是利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行檢測發(fā)生表達(dá)變化的基因,這無疑是人為界定了檢測基因的種類,縮小了獲得有意義的相關(guān)基因的范圍。而且以反芻動(dòng)物的基因芯片作為篩檢工具,在基因同源性上也可能影響差異表達(dá)基因的篩選。從宿主反應(yīng)入手,研究布魯菌感染宿主差異表達(dá)基因譜,是進(jìn)一步研究布魯菌致病分子機(jī)制的好方法。而且這些差異表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn),為布病的預(yù)防、治療、檢疫提供了更有價(jià)值的靶標(biāo)分子。

4 布魯菌病疫苗

目前研究認(rèn)為,在絕大多數(shù)情況下,使用疫苗是控制牛、羊布病的有效方法。由于布魯菌主要為胞內(nèi)寄生,抗生素對其效果甚微,機(jī)體的細(xì)胞免疫對抑制該病起了至關(guān)重要的作用。因此對布病疫苗的研究主要集中在篩選弱毒株,構(gòu)建突變株以及尋找亞單位疫苗等方面。

目前世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的布病疫苗有 2種,S19和Rev.1。在布魯菌中未發(fā)現(xiàn)自然質(zhì)粒,但可以通過基因注射、電穿孔轉(zhuǎn)移技術(shù)將泛宿主基因轉(zhuǎn)入布魯菌內(nèi)。目前對布魯菌的疫苗研究主要是利用基因工程技術(shù),對布魯菌的部分基因進(jìn)行各種修飾,以期在現(xiàn)有疫苗的基礎(chǔ)上篩選出具有更強(qiáng)免疫保護(hù)力、且毒力穩(wěn)定的弱毒株。

另外,人們也試圖研究布魯菌的DNA疫苗。由于機(jī)體的細(xì)胞免疫是控制布魯菌感染的關(guān)鍵,因此作為研究布魯菌DNA疫苗的候選分子主要集中在刺激 T細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫的幾個(gè)分子。目前對布魯菌的毒力因子和胞內(nèi)生存進(jìn)行了大量研究,但對闡明布魯菌致病機(jī)制還不夠。隨著B.melitensis[14],B.suis[15]和 B.abortus[16]全基因組完成測序,使一些新的方法應(yīng)用成為可能。如采用比較基因組技術(shù)比較不同布魯菌菌株基因組水平差異;蛋白質(zhì)組技術(shù)比較強(qiáng)毒株與疫苗株間蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。這些研究促進(jìn)了毒力因子尋找和致病機(jī)制的闡述以及疫苗、快速檢測方法和新的抗微生物藥物的研制。

5 布魯菌病的防控

中國實(shí)施的布病綜合性防控措施主要有[17]:動(dòng)物檢疫、病健分群、病畜撲殺、健康動(dòng)物計(jì)劃免疫。布病的防控主要采用畜用弱毒布病疫苗的預(yù)防接種。但免疫接種后,利用法定布病檢測方法,畜群內(nèi)接種家畜與自然感染家畜布病檢測均呈陽性,無法進(jìn)行有效區(qū)分。接種家畜對布魯菌產(chǎn)生一定的抗體,屬健康動(dòng)物。而自然感染家畜屬布病疫源動(dòng)物,必須進(jìn)行撲殺。而目前布病檢測陽性動(dòng)物難以撲殺是布病發(fā)病率上升的主要原因之一。由于現(xiàn)階段中國撲殺政策難以完全實(shí)施,國內(nèi)外又沒有針對所有的布病免疫疫苗、區(qū)分健康接種動(dòng)物與疫源感染動(dòng)物的行之有效的方法,這樣就造成傳染源長期存在,疫病持續(xù)傳播。因此準(zhǔn)確診斷布病感染動(dòng)物,正確區(qū)分健康接種動(dòng)物和自然感染動(dòng)物,研究布病致病的分子機(jī)制,對控制布病的暴發(fā)與流行、特別是傳染源的控制尤其重要。

目前全國范圍內(nèi)布病流行呈上升趨勢,而布病疫苗保護(hù)力并不十分理想,因此,除了研究有效的布病疫苗和診斷方法以外,研究布病致病的分子機(jī)制也十分重要。特別是利用基因芯片或構(gòu)建 cDNA文庫的方法,從宿主對野毒株或弱毒株感染產(chǎn)生不同的分子應(yīng)答機(jī)制入手,尋求一個(gè)合適的生物標(biāo)示分子,來區(qū)分野毒感染或人工接種,對布病的預(yù)防、治療和檢疫具有重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。

6 結(jié) 論

布病流行范圍廣,持續(xù)時(shí)間長,不但嚴(yán)重威脅人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn),同時(shí)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長期以來,布魯菌病一直受到人們的關(guān)注和重視,在美國,布魯菌還是潛在的生物戰(zhàn)劑,始終受到軍事醫(yī)學(xué)家的高度重視;而且布魯菌病在世界范圍內(nèi),特別是在發(fā)展中國家仍無法被根除,目前只有英國和澳大利亞通過嚴(yán)格的衛(wèi)生防疫措施消滅了布魯菌病。另外,據(jù)WHO專家報(bào)告,由于生態(tài)環(huán)境變化,抗生素藥物濫用及病原變異等原因,布氏菌致病性日趨嚴(yán)重,像布氏菌病一樣的傳染病仍是21世紀(jì)初全球面臨的最大的健康問題。因此,需要在全國范圍內(nèi)增加對布魯菌的重視程度,提高防范意識,加大防范力度,研制安全有效的疫苗、快速準(zhǔn)確的檢測方法和新的抗微生物藥物,這對國家安全、人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

[1] 毛開榮.動(dòng)物布魯菌病防治研究進(jìn)展[J].動(dòng)物保健,2006,37(9):37-40.

[2] 胡森,步志高.布氏桿菌病概況及其研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2003(12):9-11.

[3] 鐘旗,范偉興,何倩倪,等.用 AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(7):683-686.

[4] 王佳,徐衛(wèi)民.布魯菌病血清學(xué)診斷研究進(jìn)展[J].中國病原生物學(xué)雜志,2008,3(2):149-152.

[5] 鄭錦玲,蔣成硯,董仲生,等.布魯菌病檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué),2002,22(6):25-28.

[6] SELEEM M N,BOYLE SM,SRIRANGANATHAN N.Brucella:a pathogenw ithout classic viru lence genes[J].VetM icrobiol,2008,129(12):1-14.

[7] 唐瀏英.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在布魯氏菌感染診斷中的應(yīng)用[J].地方病通報(bào),1994,9(3):77-78.

[8] 王勝昌,邵偉娟,謝建云,等.布氏桿菌 PCR檢測方法的建立[J].上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2003,23(3):154-156.

[9] 谷登峰,金根源,程風(fēng)清,等.應(yīng)用單克隆抗體斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫法檢查布魯氏菌病抗原的初步應(yīng)用[J].中國人獸共患病雜志,1991,7(4):10-12.

[10] 魯齊發(fā),張偉,郝宗宇,等.雙抗原夾心酶免疫試驗(yàn)對人畜布魯菌抗體檢測的研究[J].中華流行病學(xué)雜志,1999,20(2):118-121.

[11] 張俊琴,陶躍華,魯齊發(fā),等.雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫試驗(yàn)診斷布魯氏菌病的評價(jià)[J].Chinese Journal of Santiary Supervision and Health,2004(3):99-101.

[12] GALDIERO E,ROMAN CC,VITIELLOM,etal.HSP and apop tosis in leukocytes from infected or vaccinated animals by Brucella abortus[J].New Microbiol,2000,23(3):271.

[13] GONZLEZM,ANDREWS E,FOLCH H,etal.Cloning,expression an dimmu nogenicity of the trans lation initiation factor 3 homologueof Brucella abortus[J].Immunobiology,2009,214(2):113-120.

[14] PATRICK SG,CHAIN D J,COMERCIM E,eta1.Whole-Genome analyses of speciation events in pathogenic Brucellae in fection and immunity[J].Dec,2005,8 353-8 361.

[15] SUPRIYA CHRISTOPHER,UMAPATHY B L,RAVIKUMARK L.Brucellosis:Review on the Recent Trends in Pathogenicity and Laboratory Diagnosis[J].JLab Physicians,2010,2(2):55-60.

[16] JACQUESGODFROID,KLAUS NIELSEN.Claude Saegerman Diagnosis of Brucellosis in Livestock and Wild life Croat Med[J].CroatMed J,2010,51:296-305.

[17] 任洪林,盧士英,周玉,等.布魯菌病的研究與防控進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(9):139-143.

(責(zé)任編輯:石瑞珍)