邢艷蘋,王 瑜,楊 峰,雷連成

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春,130062)

以往認(rèn)為埃希菌屬、沙門菌屬等腸桿科細(xì)菌表面的菌毛功能主要與細(xì)菌黏附及侵襲力有關(guān),其本身的組成成份與其致病性無直接關(guān)系。近 10余年的研究發(fā)現(xiàn),埃希菌屬卷曲菌毛的成分與臨床上的膿毒癥(sepsis)、敗血癥(septicemia)、感染性休克(septic shock)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic In flammatory Response Syndrome,SIRS)等一系列由革蘭陰性桿菌引起的嚴(yán)重感染性病癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)。

1 大腸桿菌卷曲菌毛及其編碼基因

大腸桿菌卷曲菌毛(curli)是存在于大腸桿菌表面的一種異聚蛋白絲狀附屬物,直徑 4～7 nm,長度不等[1],富含保守的 β-折疊,每個(gè) β-折疊按平行于卷曲菌毛軸線的方向相互疊加,而 β-折疊自身垂直于菌毛軸線[2]。卷曲菌毛結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定,理化抵抗力較強(qiáng),能抵抗蛋白酶消化和去污劑降解;在 10 g/L的 SDS溶液中煮沸不溶解,在體積分?jǐn)?shù)為 0.90的甲酸中才能解聚[3～5]。

大腸桿菌卷曲菌毛由操縱子基因 csg(curli subunit genes)編碼和轉(zhuǎn)錄。csg包括csgBA(C)和 csgDEFG等 2個(gè)操縱子[6～9]。前者由 csgB,csgA構(gòu)成,后者由 csgD,csgE,csgF和 csgG構(gòu)成。csgC目前尚不清楚是否存在,為假定基因(putative gene)[8],因?yàn)榧葲]有發(fā)現(xiàn)csgC的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,也沒有csgC在卷曲菌毛生物合成中具體作用的相關(guān)報(bào)道。在后續(xù)研究中,統(tǒng)一使用csgBA表示 csgBA(C)。2個(gè)操縱子向相反方向轉(zhuǎn)錄,其中 csgB和 csgD之間還有 521堿基對(duì)的間隔序列[10]。除csgD外,其他基因前都有一段編碼跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)位信號(hào)肽的序列[11]。2個(gè)操縱子在大腸桿菌株系間非常保守。

Dyer等通過 PCR檢測,發(fā)現(xiàn)所有被測的大腸桿菌無論能否表達(dá)卷曲菌毛,都可以檢測到 csgA和 csgD[12]。許多具有卷曲菌毛編碼基因的大腸桿菌并不表達(dá)和產(chǎn)生卷曲菌毛,其卷曲菌毛表達(dá)與否受到復(fù)雜因素的影響[13]。

2 大腸桿菌卷曲菌毛的致病作用

2.1 卷曲菌毛的黏附能力

卷曲菌毛的黏附性很強(qiáng),能結(jié)合許多生物體表面物質(zhì),包括纖黏蛋白、層黏連蛋白、纖溶酶原、接觸時(shí)相蛋白、Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體等[14]。體內(nèi)外試驗(yàn)表明,產(chǎn)生卷曲菌毛的細(xì)菌致病力比不產(chǎn)生卷曲菌毛的細(xì)菌更強(qiáng),包括黏附、定植和侵襲宿主細(xì)胞的能力。

大腸桿菌可以在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)產(chǎn)生卷曲菌毛[15]。卷曲菌毛增強(qiáng)禽大腸桿菌的定植和存活能力,相同菌株的卷曲菌毛表達(dá)如果受到抑制,其存活能力下降[16]。Gophna等證明,與不能產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌O 157∶H 7相比,能產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌侵襲 HEp-2細(xì)胞的能力更強(qiáng)[17]。Uhlich等通過給小鼠灌服大腸桿菌O 157∶H 7(ATCC43895)發(fā)現(xiàn),與不產(chǎn)生卷曲菌毛的變異株相比,產(chǎn)生卷曲菌毛的變異株致死小鼠的時(shí)間更短[18]。

2.2 卷曲菌毛與淀粉樣蛋白

生物化學(xué)、生物物理學(xué)和圖像分析研究表明,大腸桿菌卷曲菌毛是淀粉樣蛋白(amyloid)[19]。近年來,淀粉樣蛋白被認(rèn)為是一些疾病發(fā)生的標(biāo)志,如阿爾茨海默癥、帕金森癥、Ⅱ型糖尿病、全身性淀粉樣變性和朊蛋白相關(guān)疾病[20]。

某些株系的大腸桿菌可產(chǎn)生淀粉樣蛋白,極類似于阿爾茨海默癥在腦中堆積形成的沉淀斑 。Virchow于 1854年首次用淀粉樣蛋白描述在給病變腦組織染色時(shí)觀察到的這種沉淀,這種沉淀能和碘強(qiáng)烈結(jié)合[22]。淀粉樣蛋白還可以結(jié)合剛果紅染料、硫代黃素 T抵抗蛋白酶消化和去污劑降解[23]。

是否因?yàn)榧?xì)菌感染使這些淀粉樣蛋白形成于腦部便出現(xiàn)了阿爾茨海默癥?如果是細(xì)菌感染促使可溶性蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸蹣拥鞍?可以推測以下 2種原因:①直接通過細(xì)菌產(chǎn)生的淀粉樣蛋白致病;②間接促使體細(xì)胞生成的淀粉樣蛋白前體形成沉淀。因此,可以將大腸桿菌作為一個(gè)很好的研究淀粉樣蛋白沉積斑形成的模型系統(tǒng),深入研究可溶性蛋白轉(zhuǎn)變成淀粉樣蛋白的分子機(jī)制,進(jìn)而預(yù)防和治療淀粉樣蛋白相關(guān)疾病[24]。

2.3 卷曲菌毛與生物膜

Kanamaru等發(fā)現(xiàn),從前列腺炎病人尿道分離的大腸桿菌,其卷曲菌毛的表達(dá)和生物膜(biofilm)形成密切相關(guān)[25]。生物膜是一種附著于有生命或無生命物質(zhì)表面的被菌外基質(zhì)包裹的有組織的細(xì)菌群體[26]。卷曲菌毛促進(jìn)大腸桿菌在無生命物質(zhì)表面,如玻璃、特富龍(Telflon)、聚丙烯、聚氯乙烯等物質(zhì)表面形成生物膜[27]。卷曲菌毛相互纏結(jié),把鄰近的細(xì)菌聯(lián)結(jié)成小群落,逐漸發(fā)育為生物膜。

生物膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜,外形似“基座”狀,內(nèi)部有通水的孔道。大腸桿菌成熟生物膜中包含細(xì)菌表面蛋白、卷曲菌毛、菌外基質(zhì)。菌外基質(zhì)是一種復(fù)雜的含水環(huán)境,包含蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA和離子等。其中多糖的成分差異很大,主要是纖維素,還有 β-1,6-N-乙酰-D-葡糖胺聚合體、喬拉尼奇酸(colanic acid)、藻酸鹽等成分[28]。

與游離狀態(tài)的細(xì)菌相比,生物膜中的細(xì)菌的生理機(jī)能和新陳代謝水平不同程度降低,以抵御外界不良環(huán)境因素帶來的各種影響[29]。大腸桿菌形成生物膜后,對(duì)消毒劑、殺菌劑的抵抗力增強(qiáng);同時(shí),生物膜中的細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性也降低,使療程延長[30]。

2.4 卷曲菌毛蛋白與膿毒癥

臨床上,細(xì)菌感染引起的感染性休克、敗血癥、膿毒癥(sepsis)及全身炎癥反應(yīng)綜合征(sins)是導(dǎo)致危重病人死亡的主要原因之一 ,這其中又以革蘭陰性菌特別是腸桿菌科細(xì)菌中的大腸桿菌所占比例為大。以往認(rèn)為,革蘭陰性菌引起敗血癥、膿毒癥、感染性休克的物質(zhì)主要是細(xì)菌的菌體成分如脂多糖/內(nèi)毒素(1ipopolyrsacc hande,LPS/endotoxi),而菌毛的作用主要表現(xiàn)在對(duì)宿主細(xì)胞的黏附方面。但近年來的研究結(jié)果表明,腸桿菌科細(xì)菌表面的curli菌毛的成份cs和CsgB也與敗血癥、膿毒癥、感染性休克的發(fā)病及病情轉(zhuǎn)歸有很大關(guān)系。已有報(bào)道用大腸桿菌 MC 4100株(野生型表達(dá)curli菌毛的大腸桿菌)、MHR 261株(cs變株,可分泌 Cs蛋白,但不形成 curli菌毛)、MHR 204株(csgA突變株,不表達(dá) Cs蛋白)及 MHR 222株(csgA及 csgS雙突變株、CsgA及CsgB蛋白均不表達(dá))做體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),能表達(dá)Cs亞單位蛋白的MC4100株組和 MHR 261株組較其余兩株組誘發(fā)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子(如TNF-Ot,IL-6,IL-1等)的水平顯著要高,而且也能激活一氧化氮(nitric oxide,NO),2型一氧化氮激酶(typenitric oxde snthase,NO S2)系統(tǒng)引起血管平滑肌釋放 NO;導(dǎo)致血管平滑肌舒張、血壓下降、心動(dòng)過速和體溫降低等癥狀。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示curli菌毛的 Cs與 CsgB蛋白在此類感染性疾病的轉(zhuǎn)歸中與 LPS共同起著重要作用。

3 卷曲菌毛致病的相關(guān)因素

3.1 相關(guān)配體

作為細(xì)菌菌毛的一種,curb菌毛也在細(xì)菌的黏附過程中發(fā)揮著重要的作用。curli菌毛上的相關(guān)配體與相對(duì)應(yīng)的分子結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)菌黏附并進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)。curli上存在著層黏連蛋白、纖溶酶原、組織型纖維蛋白溶酶原、MHC I類分子、血纖維蛋白原的對(duì)應(yīng)配體,能通過與纖維結(jié)合素作用介導(dǎo)細(xì)菌粘附、侵入真核細(xì)胞的過程[30]。

3.2 NO和NOS2

在膿毒癥、感染性休克的病人血清中,正常量的NO對(duì)于機(jī)體抵抗感染性病菌入侵是必要的,但NO水平的過度升高能導(dǎo)致患者血管平滑肌舒張,從而引起患者出現(xiàn)血壓降低、心動(dòng)過速和體溫降低等癥狀,NO通過 NOS2引起的低血壓是感染性休克病人致死的一個(gè)主要原因。最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不管在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外血管平滑肌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,用不同菌株分別感染實(shí)驗(yàn)小鼠或組織培養(yǎng)液內(nèi)后,能表達(dá) CsgA和 Cs蛋白菌株組的小鼠血清內(nèi)和血管平滑肌體外培養(yǎng)液內(nèi) NO水平較 csgA或cs或csgB基因缺失菌株組的小鼠血清和血管平滑肌體外培養(yǎng)液內(nèi)的NO水平明顯為高。而實(shí)驗(yàn)中所用菌量所含 LPS(以往認(rèn)為引 N水平升高的主要物質(zhì))的量遠(yuǎn)不能刺激機(jī)體或組織細(xì)胞產(chǎn)生如此高濃度的N 0[31]。

3.3 炎癥相關(guān)因子

在膿毒癥、感染性休克、SIRS所致?lián)p害里,真正由革蘭陰性菌菌體物質(zhì)直接導(dǎo)致的損傷是很小的。病人機(jī)體的損害主要是由細(xì)菌進(jìn)入機(jī)體后引起機(jī)體自身產(chǎn)生的高水平炎癥相關(guān)分子,故臨床上病人血清中TNF-ot及 IL-6水平的升高常被作為膿毒癥、感染性休克、SIRS發(fā)生中細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)及其嚴(yán)重程度的標(biāo)志。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用大腸桿菌 MC 4 100株、MHR 261株、MHR 204株以及 MHR 222株分別感染刺激人巨噬細(xì)胞 5～6 h后,能表達(dá) CsgA蛋白的MC 4 100株和 MHR 261株組誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 NF-ot,IL-6和 II-8的量顯著高于不能表達(dá) CsgA蛋白的 MHR 222株和MHR 204株組,表明 CsgA蛋白在刺激炎癥相關(guān)細(xì)胞因子分泌中起著重要的作用。

4 結(jié)論與展望

隨著研究的不斷深入,對(duì)于大腸桿菌卷曲菌毛的認(rèn)識(shí)也在不斷加深。在體內(nèi),大腸桿菌卷曲菌毛侵入真核細(xì)胞可以躲避宿主的免疫監(jiān)測,并可以作為儲(chǔ)存器導(dǎo)致再次感染。產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌的急性感染可以導(dǎo)致膿毒血癥,慢性感染可以導(dǎo)致與淀粉樣蛋白相關(guān)的疾病。大腸桿菌卷曲菌毛的結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定,一旦卷曲菌毛在體內(nèi)積累形成淀粉樣蛋白,病程將很難逆轉(zhuǎn),目前尚無治療方法。因此,對(duì)于卷曲菌毛引發(fā)的炎癥反應(yīng)的疾病應(yīng)及早發(fā)現(xiàn)、及早治療,以預(yù)防或阻斷疾病的發(fā)生與發(fā)展。在體外,產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌可以形成生物膜。生物膜內(nèi)的大腸桿菌通過降低新陳代謝水平,增強(qiáng)對(duì)外界不良環(huán)境因素的適應(yīng)性,尤其表現(xiàn)在抗生素抗性方面。

5 存在的問題

綜上所述,產(chǎn)生卷曲菌毛的大腸桿菌的致病性比不產(chǎn)生卷曲菌毛的菌株顯著增強(qiáng)。對(duì)于卷曲菌毛的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。大腸桿菌卷曲菌毛的分子生物學(xué)特性,大腸桿菌卷曲菌毛在體內(nèi)的致病機(jī)制,大腸桿菌卷曲菌毛所致疾病的早期診斷和防控辦法,在體外參與形成生物膜的過程中大腸桿菌卷曲菌毛的具體作用,大腸桿菌是否能通過卷曲菌毛的作用在體內(nèi)形成生物膜,都是值得進(jìn)一步研究的問題。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)