顧敬敏,韓文瑜,路 榮,雷連成,楊勇軍,馮 新,孫長江,杜崇濤

(吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春,130062)

隨著對抗生素大量的使用和無節(jié)制的濫用,人們逐漸發(fā)現(xiàn)了對各種抗生素不敏感的菌株。20世紀 40年代,首次分離到對青霉素有抗性的耐藥菌株,到 60年代,耐藥性菌株已經(jīng)普遍存在[1,2]。像糞腸球菌、不動桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等病原菌對大多數(shù)的抗生素都具有很強的耐藥性。尤其是對革蘭氏陰性菌(如,不動桿菌)來說,已經(jīng)可以宣布走到了抗生素時代的盡頭[3]。

早在 1917年,噬菌體就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),并且之后受到了人們的關注。但由于當時的技術水平有限,對噬菌體的認識不透徹,因此沒有發(fā)展起來,后來漸漸被人們遺忘。20世紀 90年代末,鑒于愈來愈嚴重的細菌耐藥問題,各國研究人員又開始重新探索利用噬菌體治療致病性細菌感染的可行性問題。近幾年,噬菌體重新得到了各國研究人員的廣泛關注。隨著科學的發(fā)展,人們對噬菌體的研究逐漸深入,噬菌體及其裂解酶的應用正在逐步走向成熟。

1 噬菌體及其裂解酶概述

1.1 噬菌體

噬菌體(Bacteriophage,簡稱phage)又叫細菌病毒,是一種可以侵入細菌細胞內,通過酶的作用破壞細胞壁,使細菌裂解從而將其殺滅的病毒。噬菌體分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體,前者可在敏感宿主菌內增殖并使之裂解,亦稱為毒性噬菌體(virulent phage)[4]。

噬菌體對細菌的破壞分兩步進行[5]:(1)吸附識別;(2)裂解。

1.2 裂解酶

噬菌體裂解酶(Lysin或Endolysin)是雙鏈 DNA噬菌體所特有的、在病毒復制晚期合成的一類胞壁質水解酶。多數(shù)噬菌體具有編碼 3種細胞壁水解酶的基因,分別為裂解酶、酰胺酶和內肽酶[6],其中酰胺酶是國內外研究比較多的一種裂解酶。裂解酶的高親和性與種屬特異性的細胞壁糖基有關,而后者常常是細菌存活的必要成分。因此,細菌很難產(chǎn)生對裂解酶的抗性[7]。

2 利用噬菌體對細菌感染進行治療

2.1 噬菌體對細菌性疾病治療的可行性

近期,有很多應用噬菌體對細菌感染進行治療的報道,充分證明了噬菌體治療的可行性。

波蘭的 Miedzybrodzki等[8]對經(jīng)過噬菌體治療的伴隨細菌感染的炎癥反應的病人進行了回顧性分析,分析結果表明,在經(jīng)過噬菌體制劑治療后,病人體內的C反應蛋白(CRP)血清濃度、白細胞計數(shù)(WBC)都有明顯的降低,而紅細胞沉淀系數(shù)(ESR)沒有太大的改變。驗證了利用噬菌體制劑對病人實施治療后,確有消除由細菌感染引起的炎癥反應的特性。Denou等[9]檢測了用T4噬菌體對大腸桿菌引起的腹瀉進行了治療后噬菌體在各器官的含量,結果顯示,噬菌體在盲腸、結腸的滴度較高,而在小腸的滴度就很低,在血液、肝臟和脾臟沒有檢測到。治療 1個月后沒有發(fā)生副反應,也沒有發(fā)現(xiàn)抗 T4噬菌體的抗體形成。由以上實例可知,利用噬菌體治療沒有給動物和人造成副反應,噬菌體將可成為一種重要的候選治療制劑。

Nakai等[10]研究了在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用噬菌體防治病原菌感染水生生物的可行性。結果表明,特定病原菌感染魚群時,在附近總能分離出烈性噬菌體;當病原菌感染魚體內部時,噬菌體也會在體內找到,并能長期存在;無論是實驗條件下還是自然條件下,在魚體內都不易產(chǎn)生噬菌體的抗體。

2.2 應用純化噬菌體治療細菌感染

噬菌體可以特異性的殺滅病原菌,而不影響正常菌群的存在。Wang等[11]腹腔注射純化的噬菌體,以治療被耐 β-內酰胺類抗生素綠膿桿菌感染的小鼠,收到了良好的效果。Capparelli等[12]對感染金葡菌(包括 MRSA)的小鼠進行了噬菌體的治療。結果表明,噬菌體在體內和體外都可以殺滅受感染巨噬細胞內部的金葡菌。Biswas等[13]對一株臨床分離到的耐萬古霉素的糞腸球菌引起的小鼠菌血癥進行了噬菌體治療。研究表明,感染 45m in后用噬菌體進行治療,治愈率可達 100%,即使小鼠處于頻死狀態(tài)時再用噬菌體進行治療,治愈率也可達 50%。Chibani-Chennoufi[14]與Vinodkumar[15]也分別利用經(jīng)過純化的噬菌體對大腸桿菌感染和患多重耐藥的綠膿桿菌性敗血癥的小鼠進行了治療,效果非常好,遠勝過抗生素的治療。

除了以上用途,另外還可以將純化的噬菌體用于食品加工過程中,以防止細菌對食品的污染。García等[16]將烈性噬菌體應用到凝乳的加工過程中,對金黃色葡萄球菌進行生物控制,為乳制品加工廠解決了金葡菌污染的問題。

2.3 應用半衰期較長的噬菌體治療細菌感染

1996年Merril等[17]通過將噬菌體在小鼠體內連續(xù)的傳代培養(yǎng),篩選出了能在機體內有較長半衰期的噬菌體變異株。其中篩選到了具有長期循環(huán)特性的大腸桿菌λ噬菌體和鼠傷寒沙門氏菌 P22噬菌體。到 2005年,Vitiello等[18]又對分離出的具有長期循環(huán)特性的大腸桿菌λ噬菌體進行了進一步的研究。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)傳代后的噬菌體上E蛋白的一個氨基酸發(fā)生了替換。正是因為這一小小的變化使它在動物機體內存在的時間延長了 1 000倍以上。

2.4 應用廣譜噬菌體治療細菌感染

一般外傷感染是由幾個同種不同型的病原菌,甚至不同病原菌混合感染引起的,所以廣譜噬菌體治療具有更高的可行性。Wu等[19]以肺炎克雷伯菌為宿主菌在醫(yī)院樣品中分離到 1株噬菌體,命名為Kpp95,遺傳物質為雙股DNA,與T4噬菌體形態(tài)相似,它具有很寬的噬菌譜,除肺炎克雷伯菌(對 107株肺炎克雷伯菌中的 65株有裂解作用)外,還能裂解催產(chǎn)克雷白(氏)桿菌、聚團腸桿菌、粘質沙雷菌。這種寬譜噬菌體在感染性疾病的治療上具有很大的潛力。

Josephsen等[20]對 11年前后在干酪車間乳清中分離出的噬菌體進行了比較,發(fā)現(xiàn)“新”噬菌體比“老”噬菌體的裂解能力和裂解譜都增強了很多,致使發(fā)酵無法進行。Scholl等[21]的研究發(fā)現(xiàn)由于噬菌體 K1-5能編碼 2種尾絲蛋白,所以可以識別并裂解 2種大腸桿菌(K1和 K5)。這為人工改造噬菌體、增強其裂解譜提供了新的思路。

2.5 應用混合噬菌體治療細菌感染

對不同菌株的噬菌體混在一起,制成“雞尾酒”,“拓寬”噬菌體的裂解譜,可以彌補特異性太強的缺點,使噬菌體治療的應用性加強。Niu等[22]對臨床上感染大腸STECO 157:H 7的牛和人進行了雞尾酒噬菌體的治療。結果表明,混合噬菌體的治療效果明顯優(yōu)于單獨使用純的噬菌體(即使純噬菌體的裂解力強于混合噬菌體中的每一種噬菌體)。Denou等[9]的研究也表明混合噬菌體在很多時候優(yōu)于純的噬菌體制劑。他對利用 T4噬菌體治療由大腸引起的小鼠腹瀉的潛力和可能存在的問題作了研究。T4噬菌體不但具有屬特異性,甚至有型特異性,單獨使用一種純的噬菌體效果不佳,因此利用該類噬菌體治療大腸引起的腹瀉時必須將幾種噬菌體混到一起,形成噬菌體“雞尾酒”,才能更有效的對腹瀉進行治療。Tanji等[23]也利用噬菌體“雞尾酒”對由大腸桿菌O 157:H 7引起胃腸感染的小鼠進行了治療。

Merabishvili等[24]的研究團隊研制出了治療燒傷后由綠膿桿菌和金葡菌引感染的噬菌體“雞尾酒”制劑。他們通過對該制劑進行最適 pH、致熱原的有無、無菌檢驗、透射電鏡觀察、溫和噬菌體的剔除、噬菌體基因組的測序及原生代的分析、細胞毒性的有無、最適儲存溫度以及噴劑的穩(wěn)定性等方面的檢驗,申請到了生產(chǎn)批號,并且應用到了燒傷醫(yī)院的臨床上。估計這樣的噬菌體制劑在不久的將來會陸續(xù)的被生產(chǎn)出來。

3 對噬菌體裂解酶進行表達并應用于細菌感染的治療

到目前為止,人們對裂解酶已經(jīng)做了大量的研究。Raina[25]早在 1981年就對C群鏈球菌噬菌體的裂解酶進行了分離純化,并對其生物學特性進行了測定。Yokoi等[26]對瓦氏葡萄球菌前噬菌體的裂解系統(tǒng)(穿孔素-裂解酶)做了一些研究,將表達穿孔素和裂解酶的基因進行了原核表達及突變分析,并對表達產(chǎn)物的結構進行了分析。Obeso等[27]對金黃色葡萄球菌噬菌體 ΦH 5的裂解酶進行了原核表達,將基因 lysH 5克隆到大腸桿菌內,表達產(chǎn)物為 LysH 5。該蛋白具有 3個結構:CHAP(具有作用于半胱氨酸、組氨酸的天門冬酰胺酶/肽酶)、amidase(酰胺酶)、SH 3b(細胞壁識別結構)。并且將純化后的該蛋白用于牛奶中金黃色葡萄球菌的抑制,效果非常明顯,在 37℃作用 4 h后,就完全檢測不到該菌。這在當時是首次將噬菌體裂解酶應用于實際生產(chǎn)當中。

Delisle等[28]對內氏放線菌噬菌體Av-1的裂解酶基因進行了分離、克隆,并在大腸桿菌細胞內進行了表達。Gaeng等[29]將李斯特菌噬菌體的裂解酶基因導入到乳酸乳球菌中進行了表達。O'Flaherty[30]等對一金黃色葡萄球菌噬菌體的裂解酶也在乳酸乳球菌胞內進行了表達,并測得表達產(chǎn)物對多個型的金葡菌均具有裂解作用,其中包括MRSA。表明發(fā)酵產(chǎn)生的裂解酶在由金葡菌引起感染的治療中有很重要的應用價值。Celia等[31]對 1株乳房鏈球菌溫和噬菌體的裂解酶進行了研究,結果表明,該酶對多個型的鏈球菌都有裂解作用,提示該酶在鏈球菌引起的乳房炎的治療中有巨大的潛力。

4 噬菌體及其裂解酶的基因工程改造

現(xiàn)在,基因技術逐步走向成熟,可以利用基因工程的技術去解決上面提到的純噬菌體裂解譜窄、不具有較長的半衰期、裂解活性低等問題?？梢愿鶕?jù)具體的需要,用基因工程的方法改造噬菌體。2007年,Garcia[16]等首先在乳中分離出溫和性噬菌體,經(jīng)過隨機缺失,使之轉化為烈性噬菌體。然后將噬菌體用于乳制品加工過程中金葡菌的控制,收到了良好的效果。Yoichi等[32]針對不同型大腸桿菌的噬菌體進行了同源重組,結果表明,原來對一非宿主菌沒有裂解作用的噬菌體,當其與這一非宿主菌噬菌體的尾絲發(fā)生了重組后,就具有了裂解這一非宿主菌的能力,同時失去了裂解原宿主菌的能力。

Westwater等[33]認為可以把表達殺菌蛋白的基因(程序性死亡中的毒素基因)整合到溫和噬菌體上,然后將溫和噬菌體作為一種載體,定向的結合到宿主菌上并進行整合,然后釋放表達的殺菌蛋白,類似于生物導彈,定向的將目的菌株殺滅。Westwater團隊用實驗驗證了這一理論的可行性。

Cheng等[34]對引起新生幼兒腦膜炎的鏈球菌噬菌體的裂解酶進行了人工誘變,在變異基因表達出來的酶當中,有些酶在裂解譜沒有變的情況下,殺菌活性增強了 18～28倍。Briers等[35]對綠膿桿菌噬菌體ΦKZ的裂解酶KZ144的高親和力區(qū)域進行了研究。該區(qū)域是由幾個模塊兒嵌合組裝起來的。通過改造這個裂解酶的結合結構,從而增強綠膿桿菌噬菌體編碼的裂解酶的特異性親和力。

5 噬菌體與抗生素的結合使用

Lu等[36]對噬菌體進行了改造,然后用其與抗生素一起使用,以期能減少細菌對抗生素耐藥性的產(chǎn)生。經(jīng)過改造的噬菌體的表達產(chǎn)物可以攻擊細菌的網(wǎng)絡結構,這些都是抗生素不能直接作用的方面,形成了互補。KOHANSKI等[37]的研究表明,抗生素是通過阻止羥基形成,進而造成DNA、蛋白質、脂類的損傷,最終使細菌死亡。但 DNA的損傷會引發(fā)細胞的 SOS反應,自動對損傷的 DNA進行修復,從而減少致死性的損傷[38,39]。如果能夠敲除recA、抑制SOS反應,就可以大大增強抗生素的殺菌能力。以前曾經(jīng)報道過lexA的表達能夠抑制 SOS反應,從而能避免耐藥性的產(chǎn)生[40]。M13是非烈性的絲狀噬菌體,它不裂解細菌,而是將自身的基因整合到宿主菌的DNA上。Little等[41]對絲狀噬菌體 M13進行了改造,使其攜帶lexA3基因,它的表達產(chǎn)物是SOS反應的抑制劑。因此,經(jīng)過改造的噬菌體可以作為抗生素治療細菌感染的佐劑。

6 展 望

耐萬古霉素腸球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以及多耐藥結核桿菌等耐藥菌的出現(xiàn),使得噬菌體與裂解酶治療再度引起人們的關注。目前人們的研究興趣主要集中在應用基因工程技術改造噬菌體及其裂解酶的方面。并且人工改造噬菌體的理論和技術已趨成熟,噬菌體治療也取得了突破性的進展,顯示出了潛在的巨大應用前景。廣譜、高效、在機體內具有長期循環(huán)特性的噬菌體也同樣可以通過人工改造獲得。和抗生素治療一樣,噬菌體治療也存在著細菌對噬菌體的耐受問題,對其耐受機制的揭曉還有待進一步研究。但正如抗生素的使用存在耐藥性的問題并不排斥人類對抗生素的開發(fā)應用一樣,耐受性的問題同樣不排斥噬菌體治療臨床應用的可能性。相信隨著研究的不斷深入,噬菌體與其裂解酶應用于臨床指日可待,噬菌體的時代即將到來。

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(責任編輯:石瑞珍)