池肇春

準(zhǔn)種（quasispecies）是指同種遺傳差異性的概念，在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染者體內(nèi)，常形成以一個(gè)優(yōu)勢株為主的相關(guān)突變株病毒群稱為HBV準(zhǔn)種，它是由一種母序列和來自該系列的大量相關(guān)突變體所組成的病毒基因組。HBV病毒種群間基因序列的差異，一般不超過核苷酸總長度的2%～5%。因此，HBV準(zhǔn)種是指由遺傳學(xué)上高度相關(guān)，個(gè)體之間又有微小差別的HBV種群，在自身和外界因素的影響下優(yōu)勢和劣勢種群的構(gòu)成又處于不斷變化之中。近幾年來在慢乙肝抗病毒治療的患者中發(fā)現(xiàn)存在準(zhǔn)種基因變異。且越來越多的研究證實(shí)，HBV準(zhǔn)種的產(chǎn)生與抗病毒治療的耐藥相關(guān)。影響抗病毒療效因素很多，包括人體免疫狀況、病毒準(zhǔn)種、基因變異，在難治性病例中準(zhǔn)種可能占重要因素。

一、抗病毒治療患者肝內(nèi)外HBV的分子特征

核苷類似物特異性地結(jié)合于HBV聚合酶的底物結(jié)合部位，影響病毒復(fù)制。如果HBV聚合酶區(qū)基因突變，將導(dǎo)致某些特定部位的氨基酸被置換，使之與藥物的結(jié)合力下降，從而引起藥物敏感性降低和耐藥。目前已知常見的耐藥突變位點(diǎn)主要見于逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的A，B，C，D區(qū)。

在HBV復(fù)制途徑一個(gè)有錯(cuò)誤傾向的逆轉(zhuǎn)錄酶，潛在產(chǎn)生藥物耐藥準(zhǔn)種。長期接受抗病毒治療的患者，在肝細(xì)胞、周圍血單核細(xì)胞（PBMC）HBV變異的程度尚不明了。當(dāng)藥物耐藥和分子變異時(shí)患者血漿中有可能不能檢出HBV DNA。有報(bào)告從9例接受肝移植的乙肝患者，用敏感的PCR/核酸分子雜交方法評(píng)價(jià)NBV基因組，肝和PBMC有HBV DNA者檢測CCCDNA。結(jié)果HBV DNA血漿檢出率為43%（3/7），肝100%（9/9），PBMC 83%（5/6） 檢出 HBV DNA，HBV CCCDNAD在全部9例肝中檢出，PBMC有1例檢出。4例患者臨床診斷耐藥。HBV P基因 系列顯示，野生型HBV在血漿100%（2/2），PBMC 83%（5/6），但肝僅 33%（3/9） 檢出 HBV P，而且 66%對(duì)拉米夫定（LAM）和（或）阿德福韋酯（ADV）耐藥。轉(zhuǎn)S基因不影響HBV抗原性。從肝有抗病毒耐藥突變顯示，患者之間的準(zhǔn)種差異甚大，盡管表現(xiàn)HBV抑制，但在肝卻持續(xù)證實(shí)存在HBV復(fù)制，且可能檢出肝外HBV。最后認(rèn)為藥物耐藥與肝內(nèi)病毒準(zhǔn)種有關(guān)[1]。

有人研究LAM、ETV（恩替卡韋）序貫病毒治療HBV準(zhǔn)種群體的演變及其臨床意義。劉霖等[2]對(duì)2例采用LAM-ETV序貫的治療出現(xiàn)不同臨床結(jié)果的患者進(jìn)行了近4年的隨訪，用多聚酶鏈反應(yīng)-克隆-測序的方法研究HBV準(zhǔn)種組成的長期動(dòng)態(tài)演變，用最大似然法建立遺傳進(jìn)化樹分析代表序列的遺傳進(jìn)化關(guān)系，結(jié)合血清學(xué)和病毒學(xué)指標(biāo)分析HBV準(zhǔn)種演變與臨床過程的關(guān)系。結(jié)果2例患者出現(xiàn)了LAM耐藥病毒學(xué)反彈，采用ETV治療后，1例患者獲得持續(xù)病毒學(xué)反應(yīng)，另1例患者用ETV治療72周后又出現(xiàn)病毒學(xué)反彈。病毒學(xué)反彈均發(fā)生在原有對(duì)藥物敏感的優(yōu)勢準(zhǔn)種被耐藥株替代時(shí)。ETV耐藥與rtL180M＋S202G＋M204VDGDG三聯(lián)突變株成為優(yōu)勢準(zhǔn)種密切相關(guān)。結(jié)論認(rèn)為，HBV準(zhǔn)種組成與核苷類藥物敏感性密切相關(guān)。LAM耐藥株可進(jìn)一步演變?yōu)镋TV耐藥株，因此，對(duì)使用核苷類藥物治療的患者進(jìn)行HBV準(zhǔn)種監(jiān)測具有重要臨床意義。由于長期用核苷類或核苷類似物抗HBV治療，往往出現(xiàn)一種或多種藥物耐藥，為了提高抗病毒治療效果，因此了解病毒準(zhǔn)種特異突變菌株的發(fā)生機(jī)制也是一個(gè)重要的問題，特殊的病毒株在特殊的環(huán)境內(nèi)可產(chǎn)生HBV準(zhǔn)種[3]。

新近國內(nèi)用實(shí)時(shí)熒光PCR（RT-PCR）定量，來評(píng)估ADV耐藥時(shí)的HBV準(zhǔn)種。此方法對(duì)ADV耐藥的HBV準(zhǔn)種的敏感性和特異性100%。在32例臨床患者中20例檢出rtA181T和 rtN236T突變，20例中有 8例為雙倍體rtA181T和rtN236T 突變[4]。

二、慢性HBV感染HBV準(zhǔn)種的分子特征和功能分析

HBV自然地發(fā)生突變在HBV相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理上可能發(fā)揮作用。有人研究慢性HBV患者全長HBV準(zhǔn)種的分子特征和功能分析。Cui[5]等測定自然發(fā)生的和1例慢性乙肝患者進(jìn)行全長HBV準(zhǔn)種的功能分析。10個(gè)HBV克隆分離標(biāo)本的基因型 均為B4基因型和亞型adw。多數(shù)克隆標(biāo)本，氨基酸取代和核苷酸改變發(fā)生在核心蛋白、X蛋白和核心啟動(dòng)子的特定部位。在核心蛋白10個(gè)克隆標(biāo)本有8個(gè)是cl3L，cL60M，和cl97L。10個(gè)克隆標(biāo)本全部檢出cP130T。在X蛋白5個(gè)克隆標(biāo)本檢出xl127M，在基底核心啟動(dòng)子僅在1個(gè)克隆標(biāo)本發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A突變，2個(gè)克隆標(biāo)本在核苷1772和1773之間插入11-bp（堿基對(duì)）。6個(gè)克隆標(biāo)本在復(fù)制能力水平上競爭復(fù)制出現(xiàn)變異。結(jié)論指出，準(zhǔn)種HBV病毒基因變異顯示有不同的突變類型。

在慢性感染HBV的個(gè)體，HBV準(zhǔn)種的高度差異可增加HBV基因的變異，贊成對(duì)核苷/核苷酸類似物（NUCs）耐藥于治療前已存在的觀點(diǎn)。Pollicino等[6]在不治療的HBsAg攜帶者與LAM耐藥患者就HBV逆轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域和重迭S基因進(jìn)行比較。從100例不治療和59例LAM耐藥患者分離完整的HBV，了解它們逆轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域和重迭S基因情況。結(jié)果不治療組未檢出原發(fā)性突變對(duì)核苷/核苷酸類似物耐藥，但有46例（46%）變異聯(lián)合繼發(fā)的或伴發(fā)的突變，4例患者突變修飾S蛋白抗原性。在LAM耐藥組，除了原發(fā)LAM耐藥突變外，檢出69.5%（41/59）有原發(fā)和繼發(fā)聯(lián)合突變，其重要性在于LAM引起RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）突變，2例患者停止編碼重迭S基因和修飾S蛋白抗原性。另9例患者停止修飾S蛋白抗原性。結(jié)論指出，HBV突變伴有對(duì)NUCs耐藥，在大多數(shù)感染未治療的患者可能已經(jīng)存在對(duì)NUCs耐藥，在LAM治療期間發(fā)生基因變異也可能帶來基因突變，支持對(duì)其他NUCs耐藥和（或）潛在S蛋白免疫反應(yīng)性改變。

一個(gè)3年的前瞻性研究HBV單一感染和HIV-HBV聯(lián)合感染患者，分析HBV在核心底部啟動(dòng)子（BPC）和核心前基因（precore，Pc）部位有基因不均一性。39例HBV感染患者，20例為HBV單一感染，19例與HIV聯(lián)合感染，分離HBV 82份標(biāo)本，研究BPC/Pc基因部位準(zhǔn)種水平。結(jié)果HBV單一感染和與HIV聯(lián)合感染患者中HBV主要為A2基因型。BCP突變單一感染患者比聯(lián)合感染者多見（P＜0.0001），Pc突變主要來自e抗原陰性的HBV單一感染患者。HBV與HIV聯(lián)合感染時(shí)HBV的特征，在BPC調(diào)節(jié)部位傾向于野生型的基因類型較多，Pc部位突變?nèi)Q于基因型，但與HIV聯(lián)合存在無關(guān)[9]。隱匿性HBV（O-HBV）感染在血清的特征是存在HBV DNA和HBsAg陰性，雖然HBV/HIV聯(lián)合感染時(shí)O-HBV較多見，但有關(guān)HBV突變這一方面的分析研究不多。Martin等[7]報(bào)告33例HIV陽性血清標(biāo)本、27例慢性HBV（C-HBV）和6例O-HBV感染者的血清標(biāo)本，顯示前S、S擴(kuò)增。由于O-HBV S基因、前S基因突變，改變了抗原分泌和（或）減少復(fù)制而導(dǎo)致HBsAg不能檢出[8]。

三、HBV準(zhǔn)種與藥物反應(yīng)和耐藥的相關(guān)性

研究表明，核苷類似物的不同反應(yīng)性與HBV存在準(zhǔn)種現(xiàn)象有著密切的關(guān)系。如果我們能夠檢測患者血清中HBV準(zhǔn)種特點(diǎn)，又能清楚了解到不同準(zhǔn)種的HBV對(duì)不同藥物敏感性的差別，就有可能優(yōu)化抗病毒治療的藥物的選擇和方案的制定，從而提高抗病毒治療的效果。

根據(jù)HBV DNA序列的不同，將HBV分成不同的基因型。由于HBV基因的多樣性表現(xiàn)為8個(gè)基因型（A-H）。HBV的自然經(jīng)過和對(duì)治療的反應(yīng)可受HBV基因型的影響。HBV含有4個(gè)開放閱讀框架，即前S/S基因、前核心/核心基因、聚合酶基因和X基因。當(dāng)HBV缺乏校閱能力時(shí)周轉(zhuǎn)率很高，結(jié)果大量準(zhǔn)種自然產(chǎn)生。前S基因突變時(shí)，即使有 HBV復(fù)制也可不能檢出HBsAg，S基因突變引起抗HBs結(jié)合親和力降低，前核心突變時(shí)消除HBeAg，而基部核心啟動(dòng)子突變產(chǎn)生HBeAg基因下調(diào)?；亢诵膯?dòng)子突變伴有HBV復(fù)制增加和進(jìn)展性肝病發(fā)生，如肝硬化、肝細(xì)胞癌發(fā)生率高。聚合酶基因突變常由抗病毒治療失敗引起。若抗病毒治療前已存在突變則限制了抗病毒藥物的進(jìn)一步選擇[9，10]。因此，了解HBV變異和突變在診斷和處理HBV感染上至關(guān)重要。目前研究證實(shí)LAM耐藥主要是由rtM204V/I/S原發(fā)耐藥突變以及rtL180M、rtV173L等繼發(fā)補(bǔ)償突變所致。替比夫定（dT）耐藥突變與LAM相似。ADV耐藥主要與rtN36T或vtA181V原發(fā)耐藥突變相關(guān)。ETV耐藥突變包括rtM204和rtL180突變位點(diǎn)以及rtT184、rtS202G或rtM250其中一個(gè)ETV原發(fā)耐藥突變位點(diǎn)。

研究認(rèn)為，耐藥突變的氨基酸替換形式可影響病毒的耐藥性與復(fù)制能力。如上所述，不同的核苷類似物產(chǎn)生的耐藥突變位點(diǎn)不一樣，因此開展病毒種群大規(guī)模測序，不但可以找到已知突變位點(diǎn)，同時(shí)也可發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，加深對(duì)病毒耐藥形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

HBV感染是一動(dòng)力過程，由于藥物耐藥突變，持續(xù)抗病毒治療可引起突變?nèi)笔?。收集LAM治療失敗，后來改用阿德福韋酯（ADV）患者HBV DNA是順序在兩個(gè)不同的區(qū)域，一個(gè)是逆轉(zhuǎn)錄1kb區(qū)域，另一個(gè)是在C基因和部分前S基因在1.5kb區(qū)域，RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）區(qū)域的序列分析指出，改用ADV后LAM耐藥突變減少，最終突變不能檢出。研究發(fā)現(xiàn)，兩種抗病毒治療之間在C和前S區(qū)域準(zhǔn)種分布和缺失類型也是不同，LAM治療標(biāo)本野生型株57.7%是在結(jié)構(gòu)域，缺失在前S區(qū)域。持續(xù)治療可影響到ADV，病毒群在C基因占優(yōu)勢包含86%為81和96bp缺失，兩者較多的缺失包含T和B細(xì)胞抗原決定部位。由于C基因抗原決定部位缺失伴有LAM耐藥突變的逐漸消失，可持續(xù)對(duì)存活的HBV進(jìn)行抗病毒治療[11]。Margeridon-Thermet等[14]對(duì)HBV準(zhǔn)種用焦磷酸測序（UDPS）來了解核苷/核苷類似物耐藥突變，G到A高突變由脫輔基脂蛋白B信使核糖核酸編輯酶介導(dǎo)，由于NRTI（核苷/核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑）耐藥突變，用UDPS可檢出流行率低的HBV變異。

在臨床上有些耐藥病例并沒有檢測到已知耐藥相關(guān)突變，但臨床仍表現(xiàn)耐藥，除宿主因素外，可能與基線時(shí)準(zhǔn)種的組成有關(guān)。多數(shù)研究者認(rèn)為，病毒準(zhǔn)種異質(zhì)性越大，組成準(zhǔn)種的病毒株越復(fù)雜，其適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強(qiáng)，抗病毒治療的難度也就越大。此外，NAs耐藥補(bǔ)償突變位點(diǎn)、不同基因型、混合感染等均與抗病毒反應(yīng)有關(guān)，有待今后作更深入的研究。

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