殷杰 徐棟花 馮灝

HBV感染仍然是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性疾病，預(yù)后不良，可發(fā)展為慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和原發(fā)性肝癌。HBV感染人體后，并不直接導(dǎo)致肝細(xì)胞病變，而是在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，乙型肝炎相關(guān)抗原與宿主細(xì)胞膜或胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用，形成含有自身組織蛋白的抗原，導(dǎo)致肝細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，機(jī)體免疫系統(tǒng)被致敏，細(xì)胞免疫失去調(diào)控，體液免疫應(yīng)答亢進(jìn)，產(chǎn)生大量針對(duì)宿主自身組織的抗體，從而發(fā)生自身組織免疫反應(yīng)[1]。宿主在清除病毒的同時(shí)，也攻擊表面有病毒抗原的肝細(xì)胞，使其發(fā)生壞死，肝小葉的正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝臟代謝功能降低，纖維母細(xì)胞增生并合成膠原纖維，逐漸發(fā)展經(jīng)肝纖維化為肝硬化，甚至肝癌，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。肝臟疾病的發(fā)生伴隨著Th17及Treg細(xì)胞的異常[3，38]，它們對(duì)病毒抗原的反應(yīng)狀態(tài)不同，在疾病臨床轉(zhuǎn)歸中的影響亦不同，為探討CHB的發(fā)病機(jī)制和防治措施提供了新的思路。

一、Th17細(xì)胞概況

（一）Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) 2000年，Infante D等在萊姆病人的炎癥關(guān)節(jié)處分離到一群高分泌IL-17而不分泌IL-4、IFN-γ的CD4+T細(xì)胞[4]。有關(guān)Thl7的突破性研究進(jìn)展則主要來源于對(duì)人類自身免疫性疾病小鼠模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）、膠原誘導(dǎo)的自身免疫性關(guān)節(jié)炎（CIA）的研究。2005年，Park H在對(duì)EAE和CIA兩種自身免疫疾病動(dòng)物模型的研究過程中發(fā)現(xiàn)了一類新的CD4+T細(xì)胞亞群—Th17細(xì)胞，它能特異性分泌IL-17[5]。

（二）Th17細(xì)胞的分化與調(diào)節(jié) Thl7細(xì)胞分化需要IL-6和TGF-β的聯(lián)合作用。Ivanov II[6]等首先發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞發(fā)育、分化依賴的特異性轉(zhuǎn)錄因子——孤兒受體RORγt，而GATA3、T-bet、Smad7在控制其轉(zhuǎn)錄過程中均無作用。RORγt表達(dá)于造血干細(xì)胞、未成熟的胸腺細(xì)胞及Thl7等細(xì)胞中，在分化成熟的Thl7細(xì)胞中高表達(dá)，可通過啟動(dòng)染色體重塑機(jī)制開放IL-17的基因座位，使其他因子結(jié)合到IL-17的啟動(dòng)子上，從而誘導(dǎo)IL-17A和IL-17F基因的表達(dá)。

TGF-β和IL-6或IL-21的協(xié)同作用是誘導(dǎo)Thl7細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，TGF-β單獨(dú)作用時(shí)也可誘導(dǎo)FoxP3+的Treg細(xì)胞的表達(dá)，因此TGF-β在調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化過程中具有雙重作用，只有當(dāng)TGF-β與IL-6共同存在時(shí)才能啟動(dòng)Thl7細(xì)胞的分化。Mangan PR等[7]發(fā)現(xiàn)，外源性TGF-β是促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的主要因素；IL-6在促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化、抑制其分化為Treg的過程中起著重要作用[8]，當(dāng)體內(nèi)有炎性細(xì)胞因子IL-6存在時(shí)，F(xiàn)oxP3+T細(xì)胞的分化受到抑制，封閉IL-6的作用則促進(jìn)FoxP3+T細(xì)胞的發(fā)育。此外，Th17細(xì)胞與其分化增殖密切相關(guān)的細(xì)胞因子IL-23構(gòu)成一個(gè)IL-23/Th17軸，IL-23主要通過促進(jìn)Thl7細(xì)胞的增殖與存活，招募Thl7細(xì)胞向炎癥部位聚集[9]；IL-l和TNF-α 也具有促進(jìn) Thl7 細(xì)胞分化的作用[8，10]。研究發(fā)現(xiàn)[11，12]，細(xì)胞因子信號(hào)蛋白3（Socs3）可通過影響STAT3的磷酸化，負(fù)性調(diào)節(jié)Thl7細(xì)胞的分化；IL-6家族的新成員IL-27以STAT1依賴的方式抑制Th17細(xì)胞的分化，且這一抑制作用不依賴于IFN-γ和SOCS3。

（三）IL-17/Th17與肝纖維化之間的關(guān)系 IL-17亦稱為IL-17A，是IL-17家族（IL-17A～I(xiàn)L-17F）中的一個(gè)成員，Th17細(xì)胞通過分泌IL-17、IL-17F及IL-22，在某些抗感染免疫和誘導(dǎo)自身免疫性炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。IL-17受體（IL-17R）是一類獨(dú)特的細(xì)胞因子受體家族，目前發(fā)現(xiàn)有IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和 IL-17RE，其中 IL-17RA和IL-17RC是IL-17和IL-17F的受體[13]。研究表明，IL-17是早期出現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子，刺激人類成纖維細(xì)胞分泌IL-6、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、IL-8、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CFS）和前列腺素E2；優(yōu)先促進(jìn) CD34+造血干細(xì)胞成熟并分化為中性粒細(xì)胞[14，15]。用IL-17特異性單抗治療也能緩解CIA等自身免疫病的臨床癥狀[16]。

目前，絕大多數(shù)的研究者認(rèn)為，IL-17是一種致纖維化的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑，導(dǎo)致纖維化[17]；它可以上調(diào)小鼠心肌成纖維細(xì)胞的膠原蛋白的基因表達(dá)，還可以間接地通過誘導(dǎo)IL-6而促進(jìn)膠原聚集[15]；IL-17還參與TGF-β介導(dǎo)的器官移植后慢性排斥反應(yīng)中的纖維化過程[18]。TGF-β和IL-1β是非常關(guān)鍵的致纖維化因子，二者可通過上調(diào)IL-17的表達(dá)促進(jìn)纖維化的發(fā)[19]。IL-17在腎臟纖維化中也可能起重要作用，Zuber J等發(fā)現(xiàn)，在腎移植術(shù)后慢性排斥反應(yīng)的纖維化組織中觀察到IL-17陽性細(xì)胞的浸潤(rùn)[20]。Zhang JY等研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血和肝細(xì)胞內(nèi)Th17細(xì)胞都有表達(dá)，并可能加劇慢性HBV感染的肝臟損傷[21]。研究發(fā)現(xiàn)，CHB的肝組織炎癥反應(yīng)使肝臟間質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)TGF-β，它與IL-6共同作用可啟動(dòng)CD4+初始T淋巴細(xì)胞向Thl7細(xì)胞的迅速分化[22]。成熟的Thl7細(xì)胞能夠分泌IL-l7、IL-6等炎性介質(zhì)，IL-17又可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等炎性因子、趨化性細(xì)胞因子和金屬蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)一步協(xié)同放大炎癥反應(yīng)，引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝組織損傷[23]。

肝臟纖維化是肝臟疾病發(fā)展過程的一個(gè)階段，輕度可以逆轉(zhuǎn)，但當(dāng)不可逆性時(shí)，其轉(zhuǎn)化為肝癌的機(jī)率明顯上升。肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵，可活化為肌成纖維細(xì)胞，通過旁分泌與自分泌作用的方式，合成并分泌多種ECM，同時(shí)釋放大量基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，從而減少ECM的降解，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成大于降解，最終過量積聚在肝內(nèi)，造成肝臟纖維化。Lemmers A[24]等證實(shí)IL-17/Th17通路在酒精性肝炎患者疾病的進(jìn)展起到關(guān)鍵作用，IL-17在患者外周血中的水平明顯升高，肝組織中也出現(xiàn)大量Thl7細(xì)胞的浸潤(rùn)，且疾病嚴(yán)重程度和肝臟纖維化的程度均與Thl7細(xì)胞浸潤(rùn)程度成正比；此外，他們還發(fā)現(xiàn)在患者肝組織活檢中，肝星狀細(xì)胞表面有IL-17R的表達(dá)，患者肝組織周圍浸潤(rùn)大量分泌lL-17炎性因子的細(xì)胞，推測(cè)其是造成中性粒細(xì)胞歸巢的主要因素。Rong G等[25]對(duì)膽汁性肝硬化病人、乙型肝炎病人及正常人外周血中的Thl7、Treg細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀和RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)Thl7相關(guān)因子在膽汁性肝硬化病人外周血升高顯著，而Treg細(xì)胞數(shù)量則下降。上述研究提示，IL-17與TGF-β、TNF-α、IL-6、IL-lβ等與肝纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子之間存在著密切的生物學(xué)關(guān)系，推測(cè)IL-17/Th17可能在肝臟纖維化的發(fā)生中扮演重要的角色。

二、Treg細(xì)胞概況

（一）Treg細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) 1995年，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+T細(xì)胞回輸之后可以抑制裸鼠多種自身免疫疾病的發(fā)生，該細(xì)胞被命名為Treg細(xì)胞，其特征性標(biāo)志為FoxP3[26]。根據(jù)其來源，可分為天然Treg細(xì)胞（nTregs）和誘導(dǎo)性Treg細(xì)胞（iTregs）[27]。

（二）Treg細(xì)胞的分化與調(diào)節(jié) Treg的特征性高表達(dá)CD25、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CTLA-4）、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型腫瘤壞死因子受體（GITR）[28]及低水平的CD-127（IL-7受體α鏈）[29]，F(xiàn)oxP3是其發(fā)育、分化及維持功能的關(guān)鍵調(diào)控基因。CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞約占正常人外周血CD4+T細(xì)胞的5%～10%，主要發(fā)揮免疫抑制功能，下調(diào)機(jī)體免疫應(yīng)答的水平以維持自身耐受。Laurence A等研究表明，IL-2在維持和促進(jìn)Th1、Th2、Treg細(xì)胞功能活性的同時(shí)，卻發(fā)揮著抑制Thl7細(xì)胞分化的作用[30]。

（三）Treg細(xì)胞與CHB的關(guān)系 CHB分為免疫耐受期、免疫激活期、免疫清除期三個(gè)不同的臨床階段。Treg在不同的臨床階段發(fā)揮的功能是有差異的，一方面，它能維持免疫穩(wěn)定，防止自身免疫性肝病的發(fā)生；另一方面，Treg抑制免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝炎病毒的慢性感染持續(xù)，在一定程度上促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生。在急性肝炎、暴發(fā)性肝炎或自身免疫性肝病早期，Treg的表達(dá)頻率較低，在恢復(fù)期頻率明顯增高，而在器官移植患者中Treg功能表現(xiàn)為促進(jìn)移植耐受，提示Treg與HBV感染所導(dǎo)致的免疫耐受相關(guān)[31]。Lan RY等在對(duì)自身免疫性肝病的研究中則發(fā)現(xiàn)患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少[32]；Ormandy LA等研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者外周血中CD4+CD25+Treg的頻率與健康對(duì)照組相比顯著上調(diào)，提示Treg細(xì)胞的變化與乙肝病毒相關(guān)性肝癌的進(jìn)展可能存在相關(guān)性[33]。國(guó)內(nèi)外研究中，關(guān)于CHB患者外周血及肝組織中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的頻率及表型差異，報(bào)道并不一致，且對(duì)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞在CHB發(fā)病機(jī)制中的免疫學(xué)作用及去除CD4+CD25+Treg細(xì)胞后是否能有效增強(qiáng)HBV抗原肽誘導(dǎo)的抗HBV免疫應(yīng)答尚不確定[34]。有報(bào)道提出[35]，Treg細(xì)胞在HBV感染的持續(xù)化過程中發(fā)揮重要作用，且CHB外周血中Treg細(xì)胞的頻率與血清中HBV DNA的含量存在正相關(guān)關(guān)系。還有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的異常與乙型肝炎的慢性化及病毒清除存在密切關(guān)系，并與疾病進(jìn)展為肝硬化相關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確[34，36]。HBeAg被認(rèn)為是HBV感染的耐受原，參與誘導(dǎo)機(jī)體Treg細(xì)胞的分化，在鼠動(dòng)物模型中，HBeAg能夠誘導(dǎo)其發(fā)生T細(xì)胞免疫耐受[37，38]。眾多研究報(bào)道的異質(zhì)性可能是研究對(duì)象處于CHB的不同臨床進(jìn)展階段或研究者對(duì)Treg細(xì)胞的人為標(biāo)記（表現(xiàn)為CD4+CD25+T、CD4+Foxp3+T、CD4+CD25+Foxp3+T等）不同造成的。

三、Th17/Treg細(xì)胞

（一）Th17與Treg細(xì)胞的關(guān)系 Romagnani S等證明[39]，Thl7和Treg細(xì)胞具有共同的起源，二者的分化均依賴TGF-β。在TGF-β單獨(dú)作用下，活化的初始CD4+T細(xì)胞分化為抗炎的Treg細(xì)胞；而在TGF-β和IL-6共同作用下，活化的初始CD4+T細(xì)胞分化為促炎的Thl7細(xì)胞，IL-6在其中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。有報(bào)道稱[40]，低濃度的TGF-β可以引起RORγt的表達(dá)，高濃度的TGF-β卻抑制RORγt的表達(dá)和功能，并利于Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，促炎性Th17細(xì)胞與抑炎性Treg細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的打破可能是很多炎癥性疾病及自身免疫性疾病發(fā)生的是一個(gè)關(guān)鍵因素。

（二）Th17/Treg細(xì)胞在CHB發(fā)病中的作用 在CHB患者體內(nèi)，抗病毒的免疫功能低下或免疫耐受，主要表現(xiàn)為DC功能的低下、CD8+T細(xì)胞對(duì)HBV抗原的耐受、CD4+T細(xì)胞功能缺陷等[41]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血及肝組織中Th17/Treg 細(xì)胞的頻率異常[25，33，42，43]。Th17 細(xì)胞的肝內(nèi)聚集可能加重肝臟組織炎癥損傷，參與肝炎-肝硬化-肝癌的發(fā)生；而Treg細(xì)胞能夠抑制HBV特異的CD4+T、CD8+T細(xì)胞的增殖及IFN-γ的分泌，且Treg細(xì)胞頻率與病人血清中HBV-DNA的數(shù)量相關(guān)，提示CHB慢性進(jìn)展的不同臨床階段，患者肝組織及外周血中Treg與Th17的頻率不一、比率不同、表型及功能特征的差異可能與乙型肝炎的發(fā)病、臨床轉(zhuǎn)歸及CHB患者血清中的病毒載量有關(guān)。Zhang等[38]應(yīng)用恩替卡韋抗病毒藥物治療CHB患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著血清中HBV DNA載量的減少，外周血Th17細(xì)胞頻率升高，而Treg細(xì)胞頻率則減低，導(dǎo)致Treg/Th17比率明顯降低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著抗病毒治療、病毒復(fù)制的減少，患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）在HBcAg的刺激作用下，IL-17的分泌呈下降趨勢(shì)。提示我們，Treg和ThI7細(xì)胞的功能失衡可能是CHB抗病毒治療過程中感染持續(xù)的重要原因。研究CHB患者外周血中Thl7細(xì)胞與Treg細(xì)胞之間的相互關(guān)系，對(duì)于治療CHB及判斷CHB預(yù)后等臨床難題的意義重大。

四、展望

在CHB的發(fā)生及臨床進(jìn)展過程中，Th17/Treg發(fā)揮重要的作用。目前，對(duì)Th17、Treg細(xì)胞的研究主要集中在動(dòng)物模型及人外周血水平上，缺乏人體肝臟組織內(nèi)的相關(guān)研究，特別是關(guān)于Treg和Th17細(xì)胞的功能失衡及相互關(guān)系在CHB的發(fā)病機(jī)制及臨床轉(zhuǎn)歸中的影響。另外，通過調(diào)控Th17與Treg細(xì)胞的平衡對(duì)CHB進(jìn)行治療的策略也值得進(jìn)一步探究。

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