鄭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心 李杜娟

食品沙門氏菌檢測方法的發(fā)展

鄭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心 李杜娟

沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。沙門氏菌病除可感染人外，還可感染很多動物包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動物的繁殖生產(chǎn)力。蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，感染主要取決于沙門氏菌的血清型和食用者的身體狀況，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個體。根據(jù)國際慣例，對易受沙門氏菌污染的食品要進(jìn)行分類管理，以使大多數(shù)食物不含沙門氏菌，從而有效預(yù)防沙門氏菌病。為此，人們在探索沙門氏菌檢測方法的過程中，做出了不懈的努力。本文，筆者將有關(guān)進(jìn)展報告如下，并介紹兩種快速檢測沙門氏菌的試劑盒。

一、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法

用于沙門氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養(yǎng)方法總體可分4個不同階段或步驟。第一步（預(yù)增菌），將樣品加到一種高營養(yǎng)、無選擇性的培養(yǎng)基中，溫度37℃，使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長。雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用（由于其可保持溶液pH值穩(wěn)定），但對培養(yǎng)基的選擇仍存有爭論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長而使肉湯中同時存在的微生物數(shù)量減少，與預(yù)增菌培養(yǎng)基相似，對選擇性培養(yǎng)基的選擇，也存在許多不同的觀點。

目前應(yīng)用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯（Tetrathionate broth）、硒酸鹽胱氨酸肉湯（Selenite cystinebroth）和RV（Rappaport-Vassiliadis）培養(yǎng)基。由于沒有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗。第三步是分離步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)，并對該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測，以做出鑒定。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測法全過程需時至少4～7天，才能得出明確的診斷結(jié)果。

二、以抗體為基礎(chǔ)的檢測方法

1.利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性，來進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型。細(xì)菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測方法有許多種，大致可分為以酶標(biāo)抗體（ELISA），熒光抗體染色（免疫熒光法），同位素標(biāo)記抗體（放射免疫試驗）為基礎(chǔ)的方法及其他多種以抗體為基礎(chǔ)，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴散及免疫色譜技術(shù)的方法。但常規(guī)中最廣泛采用的是以雙位點ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法。此法改進(jìn)后用有放射活性的同位素替代標(biāo)記抗體，概括地說，是指以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來捕捉目標(biāo)抗原，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的成分，加入第二種酶標(biāo)抗體，此者結(jié)合在捕捉到的抗原的不同位點上，第二次洗滌后加入酶作用基質(zhì)，并令其與顏色成分反應(yīng)，然后用分光光度法即很容易檢測到目標(biāo)抗原。采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應(yīng)形式標(biāo)準(zhǔn)化，并促成其自動化。

2.應(yīng)用微量板ELISA法（Salmonelle test 1）對進(jìn)出口動物產(chǎn)品（魚粉、肉骨粉等）進(jìn)行沙門氏菌檢測。該法采用預(yù)先包被了沙門氏菌（A-E群）單克隆抗體的微量板，加入經(jīng)增菌處理的樣品，反應(yīng)后再加入一定的指示劑，作用畢后用酶標(biāo)儀測定OD值來判定結(jié)果。食物樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)脑鼍幚?，也可用此法進(jìn)行沙門氏菌檢測。

最新式的沙門氏菌免疫學(xué)檢測法，利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎(chǔ)。幾滴樣品加到卡片上，結(jié)果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由于無需要特殊設(shè)備，很適合小型實驗室使用。盡管卡片檢測法與ELISA法一樣需要對樣品進(jìn)行增菌處理，但它（卡片法）本身通常需時不超過10min，如果采用黎兆滾等人的樣品制備法，則可使操作時間更為縮短。

三、以核酸為基礎(chǔ)的方法

1.利用唯一一類可以攜帶信息的大分子的細(xì)胞核酸DNA和RNA作為檢測的標(biāo)靶。標(biāo)靶通常是一個特異性核酸序列，它可通過以補體核酸分子作為探針來檢出。與免疫學(xué)方法相似，探針也需要加附適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如放射性同位素、酶或發(fā)光的標(biāo)識物。Fitts等人在食品沙門氏菌檢測中引入了第一代DAN—RNA雜交技術(shù)，此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經(jīng)大約48h的增菌步驟后，檢測極限可達(dá)108個細(xì)菌/m l，但由于要使用放射性同位素，只能在專門的實驗室應(yīng)用，此方法的優(yōu)點都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎(chǔ)的第二代技術(shù)—比色計目前已發(fā)展起來。這種方法依賴于沙門氏菌核糖體RNA（rRNA）—核糖體發(fā)育過程中儲存的核酸成分的檢測。核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分，每個細(xì)菌細(xì)胞中存在5 000～20 000個復(fù)制體，而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅2～10個。這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得用無輻射計檢測成為可能，同時又保持了與放射性同位素方法相當(dāng)或更高的敏感性。其另一優(yōu)點是由于rRNA為單鏈（而DNA為雙鏈），雜交前無需經(jīng)過變性步驟。要得到陽性結(jié)果，此法需要105個靶細(xì)胞/m l，因此對沙門氏菌檢測來說，需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法更耗時，但二者成本相近。

2.食品細(xì)菌檢測法。食品細(xì)菌檢測法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴增體系方面的發(fā)展，即聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），用該體系可對制備好的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA擴增，以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測。用于檢測沙門氏菌和其他以食物為載體的病原的PCR方法業(yè)已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動化，且必須經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測反應(yīng)的某些成分。一個完整的以PCR為基礎(chǔ)的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵消了其高敏感性的優(yōu)點，但這種方法對那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌“致傷”嚴(yán)重難以復(fù)蘇而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。

盡管目前用來檢測沙門氏菌的方法各有優(yōu)缺點，但隨著科學(xué)發(fā)展，技術(shù)進(jìn)步，人們探索、實踐的繼續(xù)深入，我們可以期待，將會有更多敏感性更高、特異性更強和診斷時間更短的新方法出現(xiàn)。

四、兩種沙門氏菌快速檢測法

1.Transia沙門氏菌平板檢測法。與耗時、昂貴的傳統(tǒng)方法相比，此法快1～2天，且每次檢測所需的操作時間縮短。該法建立在夾心ELISA法的基礎(chǔ)上，利用多抗體混合物以保證檢出所有的沙門氏菌血清型。反應(yīng)的固相載體是一種有可見或不可見條紋的微量反應(yīng)板。其小孔內(nèi)包被有沙門氏菌的特異性單克隆抗體。

第一階段，在小孔內(nèi)加入樣品和抗體聯(lián)合物（沙門氏菌屬特異性單克隆和多克隆抗體的混合物）。孵育期間，沙門氏菌抗原和包被抗體形成了一種復(fù)合物：包被單克隆抗體-沙門氏菌抗原-抗體聯(lián)合物。洗滌后，通過每孔加入基質(zhì)溶液（過氧化脲）和色素原溶液（四甲基氨基丙苯）來顯示上述復(fù)合物；酶催化色素原的氧化，結(jié)果產(chǎn)生藍(lán)色。加入反應(yīng)終止液終止催化反應(yīng)，并使反應(yīng)混合物酸化，顏色由藍(lán)變黃。

這種ELISA方法可對經(jīng)選擇性增菌及熱休克作用后，釋放了特異性沙門氏菌抗原的食品和環(huán)境樣品進(jìn)行檢測。如采用黎兆滾等人的樣品制備法，可大大縮短檢測時間；此法可在沒有酶標(biāo)儀的實驗室進(jìn)行，從這點來說，Transia沙門氏菌平板檢測法比黎兆滾等人的微量板ELISA法（Salmonella test 1）更適應(yīng)于一般的實驗室使用。

2.Transia沙門氏菌卡片檢測法。此法以單步免疫反應(yīng)即夾心型免疫色譜反應(yīng)為基礎(chǔ)。反應(yīng)固相包括一塊用“抗沙門氏菌抗體-染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條，抗沙門氏菌抗體就固定在薄膜的反應(yīng)區(qū)上。增菌后，增菌肉湯用移液管加到樣品小孔內(nèi)并令其吸收，如樣品存在沙門氏菌抗原，它們會與偶合物作用，然后依次遷移到膜上，與固定在膜上反應(yīng)區(qū)的抗體結(jié)合，在反應(yīng)窗上呈現(xiàn)一條色帶。最后結(jié)果可在5～7min內(nèi)讀取。此法也適用于沒有酶標(biāo)儀的實驗室。如采用黎兆滾等人的樣品制備法，可更加縮短檢測時間，可在普通實驗室條件下進(jìn)行。