王巍杰*，楊永強，吳尚卓

（河北理工大學(xué) 化工與生物技術(shù)學(xué)院，河北 唐山063009）

0 引 言

紅豆杉是紅豆杉科、紅豆杉屬植物的總稱，為耐蔭樹種，多散生于陰坡或半陰坡的針闊混交林下。抗寒性強，可耐-30℃以下的低溫，最適生長溫度為20～25℃。分布在北半球溫帶和亞熱帶，全球共有11種，我國分布有五種，包括一變種。美國化學(xué)家Wani等[1]在1971年首次從短葉紅豆杉樹皮中提取出具有抗癌藥效的紫杉醇，使其藥用價值備受關(guān)注。

紫杉醇（pacilitaxel，商品名 taxol）是一種四環(huán)二帖化合物，因其高效的抗癌活性成為研究的熱點，研究結(jié)果[2-5]顯示紫杉醇能有效治療肺癌、卵巢癌和乳腺癌等多種癌癥。其抗癌機理主要通過附著到腫瘤細胞的微管上，誘導(dǎo)和促進微管蛋白聚合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，抑制微管的解聚，細胞大多停滯在細胞分裂的 G1期和M期直至死亡，阻止了癌細胞的分裂和擴散[6-8]。紫杉醇臨床需求量大，單純從紅豆杉中提取遠不能滿足市場需求，研究者們開始采取其他途徑獲取紫杉醇，目前正在研究的方法有人工種植紅豆杉、化學(xué)合成、生物合成、微生物發(fā)酵和細胞懸浮培養(yǎng)五種方法?；瘜W(xué)合成過于復(fù)雜，人工種植周期長，相較其他方法，細胞懸浮培養(yǎng)原料豐富，大規(guī)模反應(yīng)較易實現(xiàn)，更具應(yīng)用價值。

1 生物合成途徑

紫杉醇的生物合成是利用植物體內(nèi)易得的前體物質(zhì)經(jīng)連續(xù)的酶促反應(yīng)合成紫杉醇的方法，包括母環(huán)和側(cè)鏈的單獨合成及兩者的結(jié)合。原理是利用異戊二烯合成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸，環(huán)化形成紫杉-二烯母環(huán)骨架，經(jīng)過對C1和C2等的修飾形成紫杉醇的直接前體巴卡亭III，其中紫杉-二烯母環(huán)骨架的生成是第一個關(guān)鍵步驟[9]。Hezari M和Croteau R[10]系統(tǒng)研究了母環(huán)的形成，并提出生物合成的全過程可在無細胞酶水平上解釋。紫杉醇的側(cè)鏈由α苯丙氨酸經(jīng)β苯丙氨酸C2位的羥基化和N原子的酰基化作用而形成，側(cè)鏈沿一定順序連接到巴卡亭IIIC13氧原子上生成紫杉醇。

生物合成主要依賴酶的催化活性，Steele CL等[11]利用細胞培養(yǎng)技術(shù)分離出在紫杉醇C-13側(cè)鏈合成中起關(guān)鍵作用的苯丙氨酸變位酶PAM，并獲得了PAM的cDNA克隆，在大腸桿菌中的基因表達證明了酶的活性。紫杉醇生物合成中所有羥基化反應(yīng)均由細胞色素P450單加氧酶及其類似酶催化[12]，Jennewein S等[13]成功構(gòu)建了屬于細胞色素P450單加氧酶的紫杉二烯-5α-羥化酶的cDNA，并通過酵母細胞和昆蟲細胞的表達證明其具有編碼酶的活性。目前提出了紫杉醇生物合成的一些假設(shè)途徑，但許多關(guān)鍵酶基因尚未被克隆，它的應(yīng)用還需基因工程、分子生物學(xué)等學(xué)科發(fā)展的帶動。

2 微生物發(fā)酵途徑

一些微生物在代謝過程中會產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物紫杉醇，利用微生物發(fā)酵是獲得紫杉醇的另一途徑。1993年，Stierle A等[14]分離出一種內(nèi)生真菌(Taxomyces andreanae)，發(fā)現(xiàn)這種內(nèi)生真菌在半合成液體培養(yǎng)基中生長時會產(chǎn)生紫杉醇及其類似物，由此引發(fā)了利用微生物發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的研究熱潮。Zhao 等分離鑒定了一種產(chǎn)紫杉醇真菌，它形態(tài)與黑曲霉相似，但二者分生孢子的形狀和大小有所不同，歸類為黑曲霉的一種突變株，其耐受溫度為43℃[15]。最近，M iao Z等[16]首次發(fā)現(xiàn)一種能產(chǎn)紫杉醇的毛霉菌DA10，利用色譜分析和光譜法檢測到對肝癌治療活性。

紅豆杉的枝條、樹葉等均可用于真菌的分離[17]，但產(chǎn)紫杉醇的真菌多是紅豆杉內(nèi)生菌，菌絲不發(fā)達，在自然界中很難篩選出高產(chǎn)紫杉醇的菌株，目前利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)的紫杉醇產(chǎn)量僅為每升幾百微克，尚未形成工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。

3 細胞懸浮培養(yǎng)

細胞懸浮培養(yǎng)是利用紅豆杉等植物不同部位作為外植體，以培養(yǎng)細胞的方式生產(chǎn)紫杉醇的方法。它可以通過生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)細胞獲得代謝產(chǎn)物，且愈傷組織的來源非常豐富，不會對紅豆杉的生存造成威脅，是理想的紫杉醇獲得途徑[18]。其中外植體、培養(yǎng)基組分和誘導(dǎo)因子是影響紫杉醇產(chǎn)率的主要因素。

3.1 外植體的選取

外植體的來源廣泛，植物的根、莖、葉均可用作為愈傷組織的來源，但紫杉醇產(chǎn)率有所不同。早在1992年，F(xiàn)ett-Neto AG等[19]就研究了不同外植體對紫杉醇產(chǎn)量的影響，采用綠色和紅色的假種皮以及胚、幼莖和針葉作為愈傷組織的誘導(dǎo)。培養(yǎng)兩個月后利用高效液相色譜HPLC法分離紫杉醇，光電二極管陣列光譜測定其吸收峰顯示，紫杉醇占干重量的0.02±0.005%，并發(fā)現(xiàn)紅豆杉外植體的生長受植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D和激動素濃度影響。來源于不同種紫杉的同種組織合成的次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)率也有所不同，通過較大規(guī)模的培養(yǎng)優(yōu)選后可得到140-295mg/L紫杉醇的產(chǎn)量[20]。

紅豆杉生長緩慢，將其作為外植體的唯一來源會對樹種的生存造成威脅，為保護這種寶貴的自然資源，Bestoso F等[21]考察從其他種屬植物的細胞培養(yǎng)中提取紫杉醇的可能性，他們將歐洲榛中的莖、樹葉和胚作為外植體，用不同的激素進行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)最適合進行懸浮細胞培養(yǎng)的是胚，紫杉醇的產(chǎn)率相對于紅豆杉細胞培養(yǎng)無顯著差異，并且產(chǎn)量可通過添加激素提高。歐洲榛樹分布廣泛，外植體來源充足，且細胞培養(yǎng)周期比紅豆杉短，能最大限度減少培養(yǎng)期間的污染，有望作為紅豆杉的替代物。

3.2 培養(yǎng)基組分

細胞懸浮培養(yǎng)涉及到誘導(dǎo)愈傷組織和培養(yǎng)分散細胞系兩類培養(yǎng)基的選取。在愈傷組織誘導(dǎo)階段，用含3.0mg/LNAA、0.5mg/L的激動素、100mg/L精氨酸、2.5%蔗糖和0.8%瓊脂的MS的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩個月，可得到胚外植體86.4%的誘導(dǎo)率，樹枝誘導(dǎo)率達到100%。進一步研究表明，當FeSO4濃度從27.8mg/L增加到55.6mg/L可顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，并且在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定時間后再轉(zhuǎn)移到B5培養(yǎng)基可加快愈傷組織的生長速度[22]。如果單用B5培養(yǎng)基培養(yǎng)，最適培養(yǎng)基組分為 1%的蔗糖、0.2%的酪蛋白氨基酸和1mg/L的2,4-D[23]。

外植體經(jīng)處理成為細胞團后移至培養(yǎng)基懸浮生長，最優(yōu)的培養(yǎng)基組分既要適宜細胞正常生長，更要使紫杉醇的產(chǎn)率達到最高。研究發(fā)現(xiàn)，改變培養(yǎng)基中蔗糖、赤霉素的濃度和2,4-D與激動素的比值可以提高紫杉醇的產(chǎn)量[24]。Khosroushahi等[25]分兩階段培養(yǎng)懸浮細胞，在剛得到細胞系后的第一階段，向B5培養(yǎng)基補充硫酸氧釩，硝酸銀和氯化鈷鹽使細胞獲得最大生長速率，10天后補充1%的蔗糖和50mg/l的檸檬酸銨，第20天補充0.1mM的苯丙氨酸。培養(yǎng)25天后達到第二階段，再加入不同濃度的誘導(dǎo)劑能顯著提高紫杉醇產(chǎn)量。此外，Zhong等[26-31]已考察了從搖瓶培養(yǎng)過渡到較大規(guī)模生物反應(yīng)器反應(yīng)過程中，氧氣、二氧化碳、pH值等對產(chǎn)率的影響，對于紫杉醇大規(guī)模生產(chǎn)的研究具有指導(dǎo)意義。

3.3 誘導(dǎo)因子影響

誘導(dǎo)因子是指能促進或抑制生化反應(yīng)影響代謝產(chǎn)物合成的物質(zhì)。細胞培養(yǎng)中誘導(dǎo)因子對組織細胞的生長起著重要作用，Zhang等[32]研究了乙烯含量對紫杉醇產(chǎn)量的影響，在細胞懸浮培養(yǎng)前或培養(yǎng)中加入乙烯合成抑制劑α-異丁酸、CoCl2和NiCl2，乙烯活性抑制劑Ag+，發(fā)現(xiàn)都能提高紫杉醇的產(chǎn)率，當20 μM CoCl2和30 μM Ag+聯(lián)合應(yīng)用時可將紫杉醇產(chǎn)率提高三倍。相反，當加入乙酰水楊酸和茉莉酸等乙烯合成促進劑后，紫杉醇的產(chǎn)率明顯降低，說明在細胞培養(yǎng)中乙烯的含量是影響紫杉醇產(chǎn)量的重要因素，因此可通過加入乙烯抑制劑能增加產(chǎn)率。Rosa M等[33]在B5固體培養(yǎng)基上加入0.05或0.1mM的VSO4，培養(yǎng)歐洲紅豆杉愈傷組織兩個月后發(fā)現(xiàn)，細胞的生長速率和紫杉醇、漿果赤霉素III的產(chǎn)率都有所提高，VSO4的促進作用在細胞培養(yǎng)后期更為顯著。而Tabata H[34]發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯可顯著提高紫杉醇的產(chǎn)量，并優(yōu)化了愈傷組織的培養(yǎng)條件，研究結(jié)果顯示茉莉酸甲酯提高產(chǎn)率的原因是影響紫杉醇合成過程中骨架的形成。當茉莉酸甲酯與另一種誘導(dǎo)因子幾丁七糖共同作用時更能提高紫杉醇產(chǎn)量[35]，而膠體幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)寡糖的加入又可增強茉莉酸甲酯對紫杉醇生成的誘導(dǎo)作用[36]。

3.4 產(chǎn)物的分離與純化

細胞培養(yǎng)后先將水溶性培養(yǎng)液濾過和離心除去細胞碎屑等雜質(zhì)，可利用尼龍纖維薄膜截留紫杉醇，用合適的溶劑迅速精提紫杉醇。紫杉醇產(chǎn)物的分離常用甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醚等作為溶劑。分離效果較好的有高效液相色譜法、氧化鋁柱層析法和樹脂柱層析法[37]。Sun等[38]利用廉價高效的大孔樹脂柱層析分離出紫杉醇及其類似物，對比發(fā)現(xiàn)，AB-8樹脂具有最好的吸附和解吸能力，選取不同的解吸參數(shù)分離出10-去乙酰巴卡亭III 、7-木糖苷-10-去乙酰紫杉醇、三尖杉和紫杉醇。Zhang等[39]采用正相氧化鋁柱層析和反相C18柱層析從紅豆杉培養(yǎng)細胞浸提物中分離純化了紫杉醇，發(fā)現(xiàn)用氧化鋁柱層析后可使紫杉醇分離量增加，重結(jié)晶后可得純度超過98%的紫杉醇晶體。此外，利用海藻酸鈣凝膠固定細胞培養(yǎng)液已成為可能，固定化細胞培養(yǎng)具有產(chǎn)物分離徹底、簡便等優(yōu)點，有望廣泛用于紫杉醇產(chǎn)物的分離[40-41]。

由于紫杉醇與其類似物結(jié)構(gòu)相似，產(chǎn)物間的分離純化很難獲得理想結(jié)果。Fu等[42]為分離10-去乙酰巴卡亭III 和7-木糖苷-10-去乙酰紫杉醇，選取AB-8型樹脂進行動態(tài)吸附和吸附實驗，使二者成功分離，獲得了較高的分離度。紫杉醇和三尖杉寧堿的結(jié)構(gòu)非常相似，只是 C-13側(cè)鏈末端不同，二者不易分離，Kingston DG[43]采用四氧化鋨作為化學(xué)修飾劑，發(fā)現(xiàn)四氧化鋨可選擇性地氧化三尖杉寧堿側(cè)鏈末端的雙鍵形成二元醇，利用層析法將二者分離。若在紫杉醇和三尖杉寧堿的混合物中加入溴等鹵素，利用與三尖杉寧堿不飽和側(cè)鏈間的鹵化反應(yīng)也可分離出紫杉醇[44]。

4 展 望

隨著對助溶劑的研究，紫杉醇水溶性差的問題將被解決，其應(yīng)用也將更加廣泛，由此藥源短缺的問題會日益凸顯?；瘜W(xué)合成過于復(fù)雜，中間產(chǎn)物的鏡像對映體使合成存在較大的不穩(wěn)定性；人工種植紅豆杉的培養(yǎng)周期過長，大面積的紅豆杉人工林短期內(nèi)還無法形成；生物合成和微生物發(fā)酵的商業(yè)化還需要基因工程、分子生物學(xué)的發(fā)展來帶動，在現(xiàn)階段很難有所突破。相比之下，細胞懸浮培養(yǎng)是當前最具優(yōu)勢的紫杉醇獲得途徑。大規(guī)模的細胞培養(yǎng)已經(jīng)成為可能，對培養(yǎng)基組分的進一步優(yōu)化，可有效調(diào)控細胞的代謝途徑，獲得大量的紫杉醇及其類似物，高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜[45]等改良純化技術(shù)的應(yīng)用，可快速、高效地分離提純紫杉醇。相信隨著研究的深入，細胞懸浮培養(yǎng)途徑可在保護珍貴紅豆杉資源的前提下，滿足市場需要，解決紫杉醇藥源短缺的問題。

[1] Wani MC, Taylor HL, et al. Plant antitumor agents VI: The isolation and structure of taxol, a novel antilekem ic and antitumor agent from Taxus brevifolia [J]. J Am Chem Soc, 1971, 93: 2325-2327.

[2] Takahara S, Yamamoto H, Tokushima Y, Shiba E. Safety Evaluation of Paclitaxel Injection NK in Adjuvant Therapy for Breast Cancer [J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2009, 36(11): 1851-1856.

[3] Yoshida H, Sum i T, Abe K, Ishiko O. Pharmacokinetics of paclitaxel and carboplatin in a hemodialysis patient w ith advanced ovarian cancer [J]. Eur J Gynaecol Oncol, 2009, 30(5): 583-585.

[4] Grau JJ, Caballero M, Verger E, et al. Weekly paclitaxel for platin-resistant stage IV head and neck cancer patients [J]. Acta Otolaryngol, 2009, 129(11): 1294-1299.

[5] Sandler A, Gray R, Perry M, et al. Paclitaxel-carboplatin alone or w ith bevacizumab for non-small-cell lung cancer [J]. The New England journal of medicine, 2006, 355(24): 2542-2550.

[6] Shannon K, Canman J, Moree C, et al. Taxol-stabilized m icrotubules can position the cytokinetic furrow in mammalian cells [J]. Molecular biology of the cell, 2005, 16: 4423-4436.

[7] Weng WW, Xu YJ, et al. Molecular mechanism of radiosensitizing effect of paclitaxel [J]. Ai Zheng, 2009, 28(8):844-50.

[8] Abal M, Andreu JM, Barasoain I. Taxanes: m icrotubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action [J]. Curr Cancer Drug Targets, 2003, 3(3): 193-203.

[9] Koepp AE, Hezari M, et al. Cyclization of geranylgeranyl diphosphate to taxa-4(5),11 (12)-diene is the comm itted step of taxol biosynthesis in Pacific yew [J]. J Biol Chem, 1995, 270(15): 8686-90.

[10] Hezari M, Croteau R. Taxol biosynthesis: an update [J]. Planta Med, 1997, 63(4): 291-295.

[11] Steele CL, Chen Y, et al. Purification, cloning, and functional expression of phenylalanine am inomutase: the first comm itted step in Taxol side-chain biosynthesis [J]. Arch Biochem Biophys, 2005, 438(1): 1-10.

[12] Eisenreich W, Menhard B, et al. Mutiple oxygenase reactions in the biosynthesis of taxoids [J]. J Am Chem Soc, 1998, 120(37):9694-9695.

[13] Jennewein S, Long RM, et al. Cytochrome p450 taxadiene 5alpha-hydroxylase, a mechanistically unusual monooxygenase catalyzing the first oxygenation step of taxol biosynthesis [J]. Chem Biol, 2004, 11(3): 379-387.

[14] Stierle A, Strobel G, et al. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew [J]. Science, 1993, 260(5105): 214-216.

[15] Zhao K, Ping W, Li Q, et al. Aspergillus niger var. taxi, a new species variant of taxol-producing fungus isolated from Taxus cuspidata in China [J]. J Appl M icrobiol, 2009, 107(4): 1202-1207.

[16] M iao Z, Wang Y, Yu X, et al. A new endophytic taxane-production fungus from Taxus chinensis [J]. Prikl Biokhim M ikrobiol, 2009, 45(1): 92-96.

[17] Kumaran RS, Hur BK. Screening of species of the endophytic fungus Phomopsis for the production of the anticancer drug taxol [J]. Biotechnol Appl Biochem, 2009, 54(1): 21-30.

[18] Vongpaseuth K, Roberts SC. Advancements in the understanding of Paclitaxel metabolism in tissue culture [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2007,8(4): 219-236.

[19] Fett-Neto AG, DiCosmo F, et al. Cell culture of Taxus as a source of the antineoplastic drug taxol and related taxanes [J]. Biotechnology (N Y). 1992, 10(12): 1572-1575.

[20] Tabata H. Production of paclitaxel and the related taxanes by cell suspension cultures of Taxus species [J]. Curr Drug Targets, 2006 , 7(4): 453-461.

[21] Bestoso F, Ottaggio L, et al. In vitro cell cultures obtained from different explants of Corylus avellana produce Taxol and taxanes [J]. BMC Biotechnol, 2006, 6(45): 1-11.

[22] M ihaljevi? S, Ivana Bjedov, et al. Effect of Explant Source and Grow th Regulators on in vitro Callus Grow th of Taxus baccata L [J]. Washingtonii. Food Technol Biotechnol, 2002, 40 (4): 299-303.

[23] DM Gibson, REB Ketchum,et al. Initiation and grow th of cell lines of Taxus brevifolia (Pacific yew) [J]. Plant Cell Reports, 1993, 12(7): 479-482.

[24] Fett-Neto AG, Melanson SJ, et al. Improved grow th and taxol yield in developing calli of Taxus cuspidata by medium composition modification [J]. Biotechnology (N Y), 1993, 11(6): 731-734.

[25] Khosroushahi AY, Valizadeh M, Ghasempour A, Khosrowshahli M, Naghdibadi H, Dadpour MR, Om idi Y. Improved Taxol production by combination of inducing factors in suspension cell culture of Taxus baccata [J]. Cell Biol Int, 2006, 30(3): 262-269.

[26] Zhong JJ, Pan ZW, et al. Effect of m ixing time on taxoid production in suspension cultures of Taxus chinensis in a centrifugal impeller bioreactor [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 94(3): 244-250.

[27] Pan ZW, Wang HQ, et al. Scale-up study on suspension cultures of Taxus chinensis cells for production of taxane diterpene [J]. Enzyme M icrob Technol, 2000, 27(9): 714-723.

[28] Zhong JJ. Plant cell culture for production of paclitaxel and other taxanes [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 94(6): 591-599.

[29] Ye H, Huang LL, et al. Pulsed electric field stimulates plant secondary metabolism in suspension cultures of Taxus chinensis [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 88(6): 788-795.

[30] Qian ZG, Zhao ZJ, et al. Highly efficient strategy for enhancing taxoid production by repeated elicitation w ith a new ly synthesized jasmonate in fed-batch cultivation of Taxus chinensis cells [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2005, 90(4): 516-521.

[31] Zhou X, Zhong JJ. Effect of initial ammonium concentration on taxoid production and biosynthesis genes expression profile in suspension cultures of Taxus chinensis cells [J]. Eng. Life Sci, 2009, 9(7): 261-266.

[32] Chang-He Zhang, Jian-Yong Wu. Ethylene inhibitors enhance elicitor-induced paclitaxel production in suspension cultures of Taxus spp [J]. Cells Enzyme and M icrobial Technology, 2003, 32: 71-77.

[33] Rosa M, Cusidó, et al. Production of Taxol and baccatin III by a selected Taxus baccata callus line and its derived cell suspension culture [J]. Plant Science.1999, 146(8): 101-107.

[34] Tabata H. Paclitaxel production by plant-cell-culture technology [J]. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2004, 87:1-23.

[35] Tachinbana S, Muranaka T, Itoh K. Effect of elicitors and a biogenetic precursor on paclitaxel production in cell suspension cultures of Taxus cuspidata var. nana [J]. Pak J Biol Sci, 2007, 10(17): 2856-2861.

[36] Linden JC, Phisalaphong M. Oligosaccharides potentiate methyl jasmonate-induced production of paclitaxel in Taxus canadensis [J]. Plant Sci, 2000, 158(1-2): 41-51.

[37] Sun R, Fu K. Preparative separation and enrichment of four taxoids from Taxus chinensis needles extracts by macroporous resin column chromatography [J]. J Sep Sci, 2009, 32(9): 1284-1293.

[38] Sun R, Fu K, Fu Y, et al. Preparative separation and enrichment of four taxoids from Taxus chinensis needles extracts by macroporous resin column chromatography [J]. J Sep Sci, 2009, 32(9): 1284-1293.

[39] Zhang ZQ, Su ZG. Separation and purification of taxol using normal-and reversed-phase chromatography in tandem [J]. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2000, 16(1): 69-73.

[40] Cheng J, Yin D, Li S, Yuan Y. Activation of ERK-like MAP kinase involved in regulating the cellular proliferation and differentiation of immobilized Taxus cuspidata cells [J]. Enzyme and M icrobial Technology, 2006, 39(6): 1250-1257.

[41] Hara T, Arita T, Tachibana S, Itoh K. Paclitaxel Production by Immobilized Cell Suspension Cultures of Taxus cuspidata var. nana [J]. Biotechnology, 2008, 7(3): 557-562.

[42] Fu Y, Zu Y, Li S, et al. Separation of 7-xylosyl-10-deacetyl paclitaxel and 10-deacetylbaccatin III from the remainder extracts free of paclitaxel using macroporous resins [J]. J Chromatogr A, 2008, 1177(1): 77-86.

[43] Kingston DG. The chem istry of taxol [J]. J. Nat. Prod, 1992, 55(2): 259-261.

[44] Pandey, Ramesh C.Yankov, Luben K. Isolation and purification of paclitaxel from organic matter containing paclitaxel, cephalomannine and other related taxanes [P]. United States Patent 5654448.1997.

[45] Zhang J, Duan JC, et al. Separation and identification of Taxol in the crude extracts of Taxus cuspidata and its callus culture w ith HPLC-ESI-MS/MS [J]. Yao Xue Xue Bao. 2006, 41(9): 863-866.