何鑒清

(江蘇江山制藥有限公司，江蘇靖江 214500)

種子染菌成因探析及防治

何鑒清

(江蘇江山制藥有限公司，江蘇靖江 214500)

種子染菌嚴(yán)重影響發(fā)酵生產(chǎn)，會(huì)增加生產(chǎn)成本。文章分別從物品滅菌、種子制備環(huán)境、無菌操作和設(shè)備等幾個(gè)方面來闡述維生素C菌種在制備過程中的種子帶菌原因，操作人員在工作中的注意事項(xiàng)，以及誤判為種子帶菌等情況，并用實(shí)例加以分析說明，提出防治措施，在菌種生產(chǎn)中對(duì)避免和防止雜菌污染具有一定指導(dǎo)意義。

發(fā)酵；種子；無菌室；操作；染菌；滅菌

維生素C發(fā)酵屬于液體深層發(fā)酵，防止雜菌污染的工作尤為重要。特別是二步種子易被雜菌污染，導(dǎo)致周期延長(zhǎng)，產(chǎn)量下降，嚴(yán)重影響發(fā)酵生產(chǎn)。科技書上指出：一般種子帶菌或懷疑種子帶菌占發(fā)酵染菌率的9.64%，居發(fā)酵污染概率的第三位[1]。懷疑而不能確認(rèn)是由于確認(rèn)的手段欠缺，光學(xué)鏡檢不能確認(rèn)微米生物粒子的污染，種子是否在選育中已被溫和性噬菌體污染就更加難以確認(rèn)。一旦出現(xiàn)種子染菌，要及時(shí)組織調(diào)查，根據(jù)鏡檢、無檢平皿、留樣情況，再結(jié)合操作人員的回憶分析，找出種子染菌的原因和可能性，采取有效手段彌補(bǔ)一切可能引起種子染菌的漏洞，有針對(duì)性地解決問題。

1 種子染菌原因分析及防治

造成種子染菌的原因錯(cuò)綜復(fù)雜，通過仔細(xì)觀察和認(rèn)真分析，歸納出以下幾個(gè)方面：（1）高溫高壓蒸汽滅菌不徹底；（2）紫外線滅菌不徹底；（3）無菌室的無菌條件不符合要求；（4）操作不當(dāng)造成染菌；（5）設(shè)備以及其它原因引起的染菌。

1.1 高溫高壓蒸汽滅菌操作中注意事項(xiàng)

高溫高壓蒸汽滅菌是利用高壓蒸汽產(chǎn)生的高溫以及熱蒸汽的穿透力，使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)極易凝固變性，引起微生物的死亡，從而達(dá)到滅菌的目的[2]。

高溫高壓蒸汽滅菌操作時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）排盡滅菌器中的殘留空氣及蒸汽管道中的冷凝水，否則壓力表所顯示的壓力是水蒸汽和部分空氣壓力總和，不是水蒸汽的實(shí)際壓力，這時(shí)溫度與壓力不成比例，造成滅菌不徹底而且滅菌時(shí)間長(zhǎng)。（2）在滅菌物品的簍子上粘貼蒸汽滅菌化學(xué)指示劑，觀察變色是否均勻，來證明滅菌是否徹底。注意化學(xué)滅菌指示劑貯存條件為室溫20℃，相對(duì)濕度50%以下，避免太陽光、熒光燈、紫外燈照射。（3）滅菌完畢后，壓力降為“0”時(shí)緩緩開門，不然會(huì)造成瓶?jī)?nèi)的液體突然沸騰上升，將塞子頂出或沖濕，這樣極易染菌。

實(shí)例一：操作人員使用蒸汽滅菌器對(duì)固體培養(yǎng)基滅菌后，將分裝固體培養(yǎng)基的平皿倒置培養(yǎng)1天后，部分平皿中的培養(yǎng)基上、中、下層都出現(xiàn)細(xì)小的白色顆粒，培養(yǎng)二三天后那些白色顆粒處陸續(xù)長(zhǎng)出雜菌菌落，鏡檢是陽性芽孢桿菌。經(jīng)過觀察分析，懷疑那白色顆粒是部分瓊脂沒有化開，8瓶培養(yǎng)基中可能有2-3瓶消不透，說明蒸汽滅菌器內(nèi)溫度達(dá)不到規(guī)定溫度，且熱量不均勻。

分析：（1）蒸汽滅菌器內(nèi)冷空氣未排盡；（2）蒸汽滅菌器的冷凝水排水不暢通。

檢查：蒸汽滅菌器冷凝水排水管出口在底樓，有人用拖把堵在出汽口造成管道不暢通，拖把清理后，將進(jìn)入滅菌器前的蒸汽管道內(nèi)冷凝水排放幾分鐘，然后開滅菌器進(jìn)汽閥門，再將滅菌器內(nèi)冷凝水排放5分鐘以上，最后啟動(dòng)滅菌器開始工作。從此再也沒有出現(xiàn)上述情況，說明判斷正確。

結(jié)論：蒸汽滅菌器操作前必須排空蒸汽管道內(nèi)的冷凝水及冷空氣，再對(duì)物品進(jìn)行滅菌，在滅菌過程中溫度與壓力成比例。一般蒸汽滅菌不徹底易染陽性芽孢桿菌。

1.2 紫外線滅菌

紫外線滅菌是因?yàn)樽贤饩€引起細(xì)胞內(nèi)的核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾核酸的復(fù)制造成細(xì)胞損傷，另外紫外線還可使空氣中的氧分子變成臭氧，也有殺菌作用[3]。紫外線對(duì)革蘭氏陰性菌、噬菌體最敏感，陽性菌次之，但對(duì)芽孢桿菌及霉菌孢子不容易殺死。由于紫外線穿透力極低，一般限于對(duì)無菌室內(nèi)空氣及物體表面的滅菌。紫外線長(zhǎng)期使用后能量逐漸衰減，殺菌效果亦降低，所以，（1）一般紫外燈管照射2000h必須更換新的紫外燈管；（2）部分細(xì)菌具有光復(fù)活作用，開紫外燈時(shí)不要同時(shí)開日光燈；（3）因?yàn)樽贤饩€不能穿透玻璃，紫外線燈管不能裝入照明燈罩（玻璃板）里面。

1.3 無菌室的無菌條件要符合要求

空調(diào)凈化系統(tǒng)是采用初效、中效、高效過濾器三級(jí)過濾，以獲得所需的大量無菌空氣，來保證無菌室“四度”符合要求，無菌室內(nèi)的無菌條件必須符合以下幾點(diǎn)要求：

（1）無菌室必須符合GMP要求。（2）初效、中效、高效過濾器必須定期更換，每年對(duì)高效過濾器做泄漏檢查，確保高效過濾器檢測(cè)合格才能使用。（3）每天要數(shù)次巡回檢查空氣凈化系統(tǒng)的溫度、濕度、壓差等情況。溫度控制在20℃-22℃，相對(duì)濕度控制在55%-60%，壓差≥10Pa為宜。打掃無菌室出風(fēng)口時(shí)一定記住恢復(fù)風(fēng)閥原位，不然無菌室內(nèi)的壓差會(huì)發(fā)生變化。（4）定期對(duì)無菌室的沉降菌、塵埃粒子數(shù)、風(fēng)速、浮游菌等進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)。根據(jù)環(huán)境監(jiān)測(cè)情況及時(shí)做好清潔、滅菌處理工作，確證無菌室的無菌條件都合格。如果監(jiān)測(cè)到有極少量≥5μm塵埃粒子數(shù)，說明無菌室衛(wèi)生打掃不徹底。（5）定期用臭氧消毒器對(duì)無菌室內(nèi)空氣消毒，來減少空氣中的浮游菌。

實(shí)例二：有一次月環(huán)境監(jiān)測(cè)各項(xiàng)數(shù)據(jù)正常，不久操作人員在4#層流罩下制備種液，種液鏡檢、無檢都不染菌，此種液上罐后，小罐終點(diǎn)留樣染菌，仔細(xì)查找原因發(fā)現(xiàn)是由于4#層流罩風(fēng)速由原4.2m/s下降到2.6m/s（風(fēng)速標(biāo)準(zhǔn)為大于3.0m/s），維修后未再出現(xiàn)以上問題。

規(guī)定：必須不定期測(cè)風(fēng)速，來了解空氣的流動(dòng)速度是否達(dá)標(biāo)。

1.4 操作過程中認(rèn)真操作及注意點(diǎn)

操作人員首先要樹立無菌觀念，無菌室只是相對(duì)無菌，大自然中有無數(shù)塵埃粒子，人是帶菌者，必須保持個(gè)人衛(wèi)生，要勤用75%的酒精棉球?qū)﹄p手認(rèn)真消毒；操作時(shí)要一絲不茍，盡量不講話、減少走動(dòng)，嚴(yán)格按操作規(guī)程操作；要保持瓶壁外無種液培養(yǎng)基及菌液；移種過程塞子不可被培養(yǎng)基蘸濕；操作時(shí)碰到不潔物應(yīng)廢棄；發(fā)酵現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行種液移種到小罐時(shí)，一定要在火焰范圍內(nèi)操作，這樣可減少操作時(shí)被雜菌污染的機(jī)會(huì)，同時(shí)要克服麻痹、僥幸心理。

發(fā)酵現(xiàn)場(chǎng)消毒工、看罐工若不能正確地操作，都會(huì)誤導(dǎo)種液的無菌度。如：消毒工在消毒過程中滅菌不徹底以及誤將空氣過濾器的濾芯消化，看罐工操作時(shí)掉零磅、泡沫冒頂?shù)鹊仍斐尚」奕揪?，在不知情的情況下都誤判為種子帶菌。

實(shí)例三：G組的種液鏡檢，無檢平皿，留樣，發(fā)酵瓶24h、48h樣都不染菌，此種液接入218#小罐，小罐終點(diǎn)不染菌（這時(shí)菌種室鏡檢人員發(fā)現(xiàn)發(fā)酵瓶72h樣中有極少量的陽性桿菌，決定對(duì)G組種液停止供種），又接入228#中罐，中罐終點(diǎn)不染菌，再接入239#大罐，大罐培養(yǎng)32h時(shí)發(fā)現(xiàn)有少量的陽性桿菌，直到大罐發(fā)酵終點(diǎn)雜菌量不多，（發(fā)酵罐內(nèi)雜菌形態(tài)與G組發(fā)酵瓶72h染的雜菌形態(tài)相同）。

分析：操作過程中有極少量的微生物掉入種液瓶中，不易被留樣到，只有通過幾次擴(kuò)大培養(yǎng)才能發(fā)現(xiàn)。

實(shí)例四：懷疑C組上批種液染菌，禁止上罐。為了趕進(jìn)度，C組操作人員接種時(shí)用G組正在搖床上已培養(yǎng)22小時(shí)未做鏡檢的其中2只搖瓶培養(yǎng)液作為母種接種（僥幸心理認(rèn)為不染菌）。C組合瓶后鏡檢正常，種液接入小罐生長(zhǎng)正常，再接入中罐，中罐終點(diǎn)發(fā)現(xiàn)染少量陰性桿菌，反查小罐終點(diǎn)留樣中有極少量陰性桿菌，而G組10桶種液鏡檢正常上罐后，只有1只中罐培養(yǎng)16小時(shí)發(fā)現(xiàn)染陰性菌，其余都不染菌。

分析：由于中罐C組、G組染的陰性菌的菌形一樣，懷疑G組在無菌室接種過程中可能只有2-3只搖瓶染有極少量陰性菌，恰好是從G組拿到C組的2只搖瓶可能就是其中的1-2只，由于陰性菌的數(shù)量極少，逃過了菌種室鏡檢人員的“眼睛”，C組種液經(jīng)過冷藏、再擴(kuò)大培養(yǎng)后，雜菌在小罐培養(yǎng)后期就出現(xiàn)了。

規(guī)定：不允許用未經(jīng)證實(shí)是無雜菌的種液作為母種擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 如何避免設(shè)備及其它原因造成種子染菌

（1）菌種生產(chǎn)設(shè)備狀況也影響種子無菌度。如：層流罩有漏點(diǎn)；臭氧消毒器失靈；搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速過快，沖程過大或搖瓶?jī)?nèi)液體裝得太多，在搖瓶機(jī)上搖動(dòng)時(shí)，液體濺到塞子上易引起染菌；恒溫培養(yǎng)箱的溫控要好，若失靈有時(shí)會(huì)誤判染菌，所以鏡檢人員要積累生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)來增強(qiáng)判斷能力。（2）發(fā)酵現(xiàn)場(chǎng)設(shè)備的好壞也會(huì)影響種液的無菌度。如：罐體、管道上有沙眼（很難看出）、總空氣系統(tǒng)帶菌以及不明原因染菌的情況下都誤判為種子帶菌。（3）菌種生長(zhǎng)必須有一個(gè)清潔的環(huán)境。潔凈區(qū)域墻壁、地面及設(shè)備都必須用消毒劑認(rèn)真擦洗，空間采用消毒劑噴霧處理。消毒劑每月更換，防止產(chǎn)生耐藥菌株。（4）如果分離平皿染菌、茄瓶斜面染菌或種液染菌，立即將所有物品高溫滅菌倒入下水道，對(duì)所用設(shè)備和無菌室必須用消毒劑反復(fù)認(rèn)真擦洗，空間噴霧消毒，并開紫外燈及臭氧滅菌。

2 結(jié)語

雜菌無孔不入，因此不能機(jī)械地孤立認(rèn)為某種染菌現(xiàn)象必定是某一原因或渠道所致，應(yīng)當(dāng)把染菌的時(shí)間、菌形和雜菌存在的環(huán)境等方面的情況聯(lián)系起來加以綜合分析，才能作出符合實(shí)際的正確判斷，從而采取相應(yīng)的有效措施，制服染菌?？傊?，只要各級(jí)操作人員工作負(fù)責(zé)，設(shè)備完好，種子不帶菌，小罐染菌率會(huì)降至0。

[1]陳代杰,朱寶泉,等.工業(yè)微生物菌種選育與發(fā)酵控制技術(shù)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,1994.

[2]林雅蘭,羅大珍,等.微生物學(xué)[M].北京:北京大學(xué)出版社,2011. [3]王宜磊,等.微生物學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

Cause Analysisand Prevention of BacterialContam ination of Seed

HE Jian-qing
(Aland(Jiangsu)NutraceuticalCo.,Ltd.,JingjiangJiangsu214500,China)

Bacterial contamination of seed affects fermentation production seriously,and canincrease costof production greatly.In this paper,Iw illanalysis the cause ofbacterialcontamination of seed of vitamin C during the preparation process,mattersneeding attention for operators atwork,andm isjudgmentof contaminated seed from some aspects as follows:sterilization,seed preparation environment,aseptic technique and equipment.Then Iw ill illustratemy view w ith some examples and give some advice for controlmeasures.Ithink this paperhave agreatsignificance to avoid and preventbacterial contam ination during the production.

fermentation;seed;sterile room;operating;contam ination;sterilization

Q93

A

1671-0142（2011）05-0076-03

何鑒清（1964-）,女,江蘇靖江人,工程師.

（責(zé)任編輯 李冠楠）