韓英 盛劍秋

北京軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科

大腸癌分子生物學(xué)技術(shù)及其轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究在 CRC篩查和診斷方面具有重要臨床意義。

1 大腸癌分子路徑

大腸癌分子路徑主要有三種：（1）染色體不穩(wěn)定(CIN)路徑：占全部散發(fā)性CRC病例的70%～85%以上；（2）CpG 島甲基化表型 (CIMP) 路徑：導(dǎo)致散發(fā)性CRC的另一條主要路徑，包括高度MSI不穩(wěn)定(MSI)所致的散發(fā)性CRC；（3）純微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）路徑：由于DNA錯(cuò)配修復(fù) (MMR) 基因胚（種）系突變，例如遺傳性非息肉病性大腸癌 (HNPCC) 。

參與CIN路徑的基因異常包括：APC基因，KRAS基因突；TP53基因。APC或β-catenin基因突變頻率，在腺瘤早期高達(dá)80%。APC基因突變的發(fā)現(xiàn)率，結(jié)腸癌約為60%，直腸癌約為82%。TP53 基因是腺瘤演變?yōu)橄侔┑膫鹘y(tǒng)路徑中的晚期事件；SMAD4蛋白胚系突變會(huì)導(dǎo)致幼年性息肉病綜合征，此病和CRC有關(guān)。在CIN路徑導(dǎo)致的CRC中，完全具備全部上述分子生物學(xué)異常者只占極少數(shù)。

MSI是一種重要的基因組不穩(wěn)定路徑。在腫瘤和胚系細(xì)胞DNA的微衛(wèi)星區(qū)域內(nèi)，核苷酸重復(fù)序列復(fù)制錯(cuò)誤，因而造成不穩(wěn)定性。復(fù)制這些短的重復(fù)序列時(shí)，DNA聚合酶非常容易出錯(cuò)，此種錯(cuò)配修復(fù)（MMR）功能障礙導(dǎo)致了MSI。MMR系統(tǒng)組成至少有7種蛋白，MLH1基因、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2，7種蛋白間特異性結(jié)合，形成功能性異二聚體（heterodimers）。MLH1和MSH2在錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制中是不可或缺的，具有五種功能性異二聚體蛋白（heterodimeric proteins）（MSH2-MSH3，MSH2-MSH6，MLH1-PMS1，MLH1-PMS2，MLH1-MLH3）。

HNPCC與MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的基因突變有關(guān)。檢測兩種單核苷酸（BAT25和Bat26）和三種二核苷酸（D5S346、D2S123和D17S250）。MSI-高度不穩(wěn)定（MSI-H）：上述5個(gè)檢測位點(diǎn)中，MSI≥2（40%）；MSI-低度不穩(wěn)定（MSI-L）：只有一個(gè)檢測位點(diǎn)陽性；微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）：5個(gè)檢測位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定性。

CIMP路徑是散發(fā)性CRC的另一常見路徑，約占散發(fā)性CRC的15%。CIMP路徑中啟動(dòng)子區(qū)的甲基化異常，關(guān)鍵的抑癌基因（如MLH1）表達(dá)失活，導(dǎo)致表觀遺傳不穩(wěn)定性，是散發(fā)性CRC的重要機(jī)制。CIMP陽性：3個(gè)以上的基因啟動(dòng)子位點(diǎn)PMR≥10。CIMP陽性與BRAF基因突變密切相關(guān)；可分為兩型：CIMP-高（或CIMP1）：與BRAF基因突變相關(guān)，CIMP-低（或CIMP2），與KRAS基因突變相關(guān)，其病理學(xué)癌前病變的特征為絨毛腺瘤；細(xì)化分型的目的是為了深入探討癌變機(jī)制。CIMP陽性CRC具有明確臨床及病理特征：腫瘤好發(fā)于近端結(jié)腸，多見于中老年女性（最終的表型取決于是否伴發(fā)因基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致MLH1轉(zhuǎn)錄沉默所誘導(dǎo)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性）。CIMP陽性+非MSI-H表型CRC病理的浸潤進(jìn)展更嚴(yán)重，臨床預(yù)后及轉(zhuǎn)歸較差；病理組織中缺乏腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞；CIMP路徑的癌前病變主要是無蒂鋸齒狀腺瘤。典型的CIMP陽性+MSI-H CRC 與純MSI-H CRC的特征相似，預(yù)后較好。腺瘤性息肉（從單純腺瘤發(fā)展為進(jìn)展期腺瘤，最終形成浸潤性腺癌）是CIN路徑CRC以及HNPCC的癌前病變。鋸齒狀息肉（也是很重要的一種息肉）是CIMP路徑CRC的癌前病變 。

已經(jīng)建立了家族性CRC綜合征從實(shí)驗(yàn)室到臨床（bench to bedside）的診斷方法，是大腸腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的最前沿水平。家族性CRC綜合征研究成果有助于深化對(duì)CRC的認(rèn)識(shí)。

2 大腸癌分子生物學(xué)檢測對(duì)臨床診療的指導(dǎo)

大腸癌分子生物學(xué)檢測對(duì)臨床診療的指導(dǎo)包括以下幾個(gè)方面：

（1）FAP是常染色體顯性遺傳綜合征。APC基因胚系基因突變（APC是CIN路徑中的重要基因）。特征是大腸腺瘤數(shù)目＞100個(gè)。如果沒有手術(shù)干預(yù)，所有FAP病例均于50歲前發(fā)展為CRC。

（2）APC基因突變位點(diǎn)影響疾病的表型（無論是病變嚴(yán)重程度抑或相關(guān)的腸外特征都會(huì)受到影響）。APC基因中心區(qū)發(fā)生突變，大腸腺瘤數(shù)目較多，為典型FAP；

突變發(fā)生在基因兩端的3（或5）時(shí)，導(dǎo)致一種較為溫和的表型即所謂的衰減型FAP（AFAP），其特點(diǎn)是大腸腺瘤數(shù)目＜100個(gè)，CRC發(fā)生發(fā)展緩慢，比典型FAP延遲大約15年。

（3）MUTYH。MUTYH是一種DNA糖基化酶，幫助修復(fù)由于DNA氧化損傷導(dǎo)致的堿基錯(cuò)配防止基因突變（例如APC和KRAS），在CIN路徑CRC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DNA修復(fù)缺陷是MAP的病因；MAP是一種常染色體隱性遺傳疾病，導(dǎo)致多發(fā)性大腸腺瘤和癌癥。MAP在表型上和AFAP相似。MUTYH雙等位基因突變導(dǎo)致CRC風(fēng)險(xiǎn)增加93倍。

（4）MAP臨床遺傳學(xué)檢測、篩查及咨詢。應(yīng)對(duì)下列對(duì)象進(jìn)行APC和MUTYH基因胚系突變檢測、篩查及臨床遺傳學(xué)咨詢：大腸腺瘤＞20個(gè)（包括異時(shí)性病變）；發(fā)病年齡＜60歲、腺瘤數(shù)目＞/ = 5，本人或一、二級(jí)親屬中60歲前患CRC或高級(jí)別異型增生腺瘤者。檢測程序通常會(huì)根據(jù)家族史而定。 已經(jīng)確定的臨床病理標(biāo)準(zhǔn)可用于判定HNPCC“高?！被颊呒坝H屬；“高?！闭邞?yīng)接受進(jìn)一步的分子生物學(xué)檢測：MSI分析以及免疫組化法檢測與HNPCC相關(guān)的四個(gè)MMR蛋白質(zhì)，即MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。如果MSI-H或腫瘤組織中選擇性表達(dá)蛋白質(zhì)缺失，則先證者需要接受胚系基因檢測。HNPCC與 BRAF基因突變無關(guān)。BRAF檢測具有新的意義：BRAF陽性可以確定為CIMP路徑散發(fā)性CRC，從而排除HNPCC；臨床上，MSI-H+BRAF陽性CRC有助于判定其源于CIMP路徑MLH1基因甲基化，而不是HNPCC。

3 我們的研究工作

目前，我們已建立起以北京為中心，輻射北方地區(qū)的HNPCC協(xié)作組，共收集約200余個(gè)HNPCC家系。資料包括：患者腫瘤組織切片、患者及家系成員外周血樣本、提取的DNA、RNA以及相關(guān)臨床資料。建立了HNPCC MMR基因檢測綜合研究平臺(tái)。包括免疫組化檢測蛋白表達(dá)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測、突變檢測、基因測序、大片段缺失和啟動(dòng)子甲基化檢測等技術(shù)。利用該平臺(tái)對(duì)106個(gè)中國北方地區(qū)HNPCC家系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，43個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)了致病性突變。

在14個(gè)FAP家系先證者中發(fā)現(xiàn)9例微小突變，突變檢出率為64.3%。包括6個(gè)移碼突變，2個(gè)剪接區(qū)突變和1個(gè)無義突變。發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的APC基因微小突變。在微小突變檢測陰性的5例患者中，用MLPA的方法檢測出2例存在大片段缺失，這兩種大片段缺失均未見報(bào)道，大片段缺失的檢出率為14.3%。微小突變與大片段缺失的總檢出率為78.6%。

目前，EGFR受體導(dǎo)向治療前常規(guī)進(jìn)行KRAS基因檢測。單克隆抗體西妥昔單抗（cetuximab）和帕尼單抗（Panitumumab）的靶點(diǎn)是表皮生長因子受體（EGFR） 和RAS-RAF-MEK-ERK路徑，在治療轉(zhuǎn)移性CRC方面發(fā)揮重要作用。KRAS突變、野生型KRAS但BRAF或PIK3CA突變，對(duì)表皮生長因子受體導(dǎo)向治療無反應(yīng)。