葛麗麗 綜述;楊小昂 審校

(鄭州大學(xué)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南鄭州450052)

肝癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展

葛麗麗 綜述;楊小昂 審校

(鄭州大學(xué)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南鄭州450052)

肝癌;干細(xì)胞;標(biāo)志物

肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要分布于亞洲東南部和撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)，近25年，美國(guó)和歐洲地區(qū)發(fā)病率也在持續(xù)增加。肝癌的死亡率僅次于肺癌和結(jié)腸癌排名世界第三。預(yù)計(jì)未來(lái)20年，其發(fā)病率和死亡率還會(huì)成倍上升［1－2］。然而目前肝癌的發(fā)病機(jī)制仍不明確，尋找其有效靶點(diǎn)，探明發(fā)病機(jī)制迫在眉睫。隨著研究的深入，在越來(lái)越多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)的存在［3－5］，以此推測(cè)在肝癌中可能也存在肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells，LCSCs)。本文對(duì)近年來(lái)的肝癌干細(xì)胞研究的最新進(jìn)展作一綜述。

1 腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)最先由Hamburger和Salmon提出，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為:腫瘤的形成和發(fā)展是由一小群具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞主導(dǎo)的過(guò)程，這類細(xì)胞在啟動(dòng)腫瘤形成和生長(zhǎng)過(guò)程中起著決定性作用，是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。他們通過(guò)軟瓊脂集落形成等一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一學(xué)說(shuō)［3－4］。Passegué等［5］證明了AML細(xì)胞中只有0.2%～1.0%的細(xì)胞亞群有持續(xù)的克隆形成能力，并分離出這些Thy－、CD34+、CD38－細(xì)胞，再移植入NOD/SCID小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)它們是惟一能在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成移植瘤的細(xì)胞，從而證明了這些細(xì)胞就是腫瘤干細(xì)胞。Reya等［6］通過(guò)對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤的研究提出了系統(tǒng)的CSCs學(xué)說(shuō)，并認(rèn)為CSCs不僅存在于血液系統(tǒng)腫瘤，還存在于其他實(shí)體瘤中。目前，已有研究表明:在白血病、乳腺癌、人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、肺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌和卵巢癌等實(shí)體瘤中相應(yīng)的CSCs存在的可能性［7－12］。CSCs除具有自我更新和多向分化能力等正常干細(xì)胞的基本特性外，還具有腫瘤細(xì)胞的特性，能夠維持腫瘤的增殖和生長(zhǎng)，逃避內(nèi)源性及外源性調(diào)控自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)制，并通過(guò)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［13］。

2 肝癌干細(xì)胞的來(lái)源

目前，關(guān)于肝癌干細(xì)胞的來(lái)源有兩種觀點(diǎn):1)肝癌干細(xì)胞起源于成熟肝細(xì)胞的去分化［14］;2)起源于肝干細(xì)胞的成熟受阻。根據(jù)CSCs學(xué)說(shuō)，肝癌干細(xì)胞可能來(lái)自于肝干細(xì)胞的突變。近些年來(lái)，隨著對(duì)于肝干細(xì)胞在肝癌形成過(guò)程中重要性的深入認(rèn)識(shí)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明肝癌干細(xì)胞起源于肝干細(xì)胞［15－18］。肝干細(xì)胞的來(lái)源有兩種可能，1)肝內(nèi)來(lái)源即在肝臟發(fā)育成熟后，組織內(nèi)仍保留少量處于休眠狀態(tài)的干細(xì)胞;2)肝外來(lái)源即肝干細(xì)胞來(lái)源于其他組織，例如骨髓等。

Grozdanov等［15］將癌胚蛋白Gpc3可以作為肝祖細(xì)胞的標(biāo)志物，并通過(guò)建立Solt-Farber肝臟致癌模型研究證實(shí)肝祖細(xì)胞/卵圓細(xì)胞與肝癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。卵圓細(xì)胞是一類胞核呈卵圓形的小上皮細(xì)胞，是肝內(nèi)膽管系統(tǒng)源性多潛能分化細(xì)胞群，既可向膽管細(xì)胞分化，又可向肝細(xì)胞分化，主要位于胚胎肝臟或成年肝臟的膽管末端Hering管。當(dāng)肝臟損傷時(shí)，卵圓細(xì)胞能大量增殖，并遷移至肝臟實(shí)質(zhì)，分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，修復(fù)和重建肝臟。Dumble等［16］對(duì)敲除p53基因小鼠喂缺乏膽堿而補(bǔ)充乙硫氨酪酸的飲食，誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞大量增生，分離卵圓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將有永生化特性的細(xì)胞接種入NOD/SCID小鼠皮下長(zhǎng)出與肝細(xì)胞癌相似的腫瘤，確定其由卵圓細(xì)胞分化而來(lái)，說(shuō)明卵圓細(xì)胞可能參與肝癌的形成。

普遍認(rèn)為肝干細(xì)胞主要存在于膽管末端Hering管中，但Oliva等［17］通過(guò)免疫組化和RNA-FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌組織中有肝干細(xì)胞的存在。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞與肝干細(xì)胞表達(dá)共同的表面標(biāo)志物，也提示肝細(xì)胞癌可能起源于肝干細(xì)胞［18－19］。最近研究在肝癌組織中的具有干細(xì)胞特征的EpCAM(+)細(xì)胞引導(dǎo)了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步提示肝干細(xì)胞與肝癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系［20］。

3 肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物

肝干細(xì)胞可能為肝癌干細(xì)胞的來(lái)源，因此肝干細(xì)胞表達(dá)的某些表面標(biāo)志物可能成為肝癌干細(xì)胞篩選的參考標(biāo)志物。近年來(lái)，研究者從肝癌組織和細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了CK7、CKI9、AFP、c-kit、OV6、Thy-1(CD90)、CD34等多種肝干細(xì)胞標(biāo)志物。

CD133對(duì)于肝癌干細(xì)胞的研究具有一定的價(jià)值。據(jù)報(bào)道，在人肝癌細(xì)胞系中，CD133+細(xì)胞存在的比率是0%～65%，并具有高度增殖分化潛能和體內(nèi)成瘤能力及干細(xì)胞樣特性［21－23］。Suetsugu等［22］檢測(cè)3個(gè)肝癌細(xì)胞系中僅Huh-7細(xì)胞亞群表達(dá)CD133，且僅有CD133陽(yáng)性細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、分化和成瘤能力。同樣，Chiba等［23］研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞系Huh-7細(xì)胞中具有表達(dá)CD133的干細(xì)胞，并且CD133+細(xì)胞具有更高的增殖潛能和體外分化能力。將CD133+細(xì)胞純化后，與CD133－細(xì)胞同時(shí)接種于裸鼠背部皮下，觀察比較兩者的成瘤能力，結(jié)果顯示:CD133+細(xì)胞僅需1× 103個(gè)細(xì)胞即可在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，證明CD133+細(xì)胞具有更高的成瘤性。Sasaki等［24］對(duì)136個(gè)肝癌標(biāo)本通過(guò)免疫組化分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)估CD133表達(dá)和臨床病理學(xué)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CD133的表達(dá)與肝癌患者的生存率及預(yù)后密切相關(guān)。最近，Kohga等［25］又通過(guò)金屬蛋白酶的研究進(jìn)一步證實(shí)了CD133+細(xì)胞在肝癌中的惡性潛能和特性。

CD90是一種相對(duì)分子質(zhì)量25 000～37 000的糖蛋白，主要在白血病、骨髓間充質(zhì)、乳腺癌、肝干/祖細(xì)胞細(xì)胞中表達(dá)［26－27］。Yang等［28］通過(guò)肝癌細(xì)胞系、肝癌組織和肝癌患者血樣的研究，發(fā)現(xiàn)所有的肝癌標(biāo)本和91.6%的肝癌患者血樣中都有CD90+CD45－細(xì)胞群，將其分離出來(lái)接種到裸鼠和SCID/Beige小鼠體內(nèi)能很好的成瘤，還通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)證明了CD90+CD44+比CD90+CD44－具有更強(qiáng)的侵襲力，并與肝癌的原處和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

最近，Haraguchi等［29］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，CD13是肝癌干細(xì)胞系中處于半靜止?fàn)顟B(tài)的一種標(biāo)志物，主要存在于細(xì)胞周期的G0期，在腫瘤的中心形成細(xì)胞簇。通過(guò)藥物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在鼠異種移植物模型中，CD13抑制劑能夠有效的抑制腫瘤的自我更新和形成靜止期腫瘤干細(xì)胞。由于腫瘤干細(xì)胞通常處于靜止期，細(xì)胞周期循環(huán)較慢，而臨床上使用的抗癌藥大多是針對(duì)處于活躍期的腫瘤細(xì)胞起作用，從而導(dǎo)致肝癌對(duì)放化療不敏感。故認(rèn)為 CD13是肝癌干細(xì)胞的一種候選標(biāo)志物。

EpCAM是最近發(fā)現(xiàn)的又一種新的標(biāo)志物，Terris等［30］對(duì)235個(gè)肝癌標(biāo)本進(jìn)行基因圖譜和免疫組化分析，并通過(guò)流式分選儀分選出EpCAM+細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ep-CAM+具有干細(xì)胞樣特性，且在免疫缺陷小鼠體內(nèi)能夠形成高度侵襲性的腫瘤;Wnt/beta聯(lián)蛋白的活化可以強(qiáng)化EpCAM+細(xì)胞的能力，而RNA干擾則可抑制EpCAM+細(xì)胞，從而得出結(jié)論，肝癌的生長(zhǎng)和侵襲性與EpCAM+細(xì)胞密切相關(guān)。從肝癌組織和細(xì)胞中分析出其所占的比例最高可達(dá)99.2%，且2×102個(gè)細(xì)胞即可在裸鼠體內(nèi)成瘤，相對(duì)于其他標(biāo)志物有更高的成瘤性［20］。

4 SP細(xì)胞與肝癌干細(xì)胞

側(cè)群(side pulation，SP)細(xì)胞分選方法已被廣泛應(yīng)用于分選和鑒定腫瘤干細(xì)胞。SP細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為腫瘤干細(xì)胞的鑒別和分離提供了一種新的手段。該方法借助于SP細(xì)胞能排出Hoechst 33342染料這一特性，Hoechst 33342染料的排出依賴細(xì)胞膜上的一種ATP結(jié)合蛋白(ABCG2)運(yùn)載體。

SP細(xì)胞也已應(yīng)用于肝癌干細(xì)胞的鑒別。研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中存在側(cè)群細(xì)胞，其具有干細(xì)胞樣特性。SP細(xì)胞雖不等同于肝癌干細(xì)胞，但SP細(xì)胞至少組成了肝癌干細(xì)胞的一部分。Shi等［31］研究表明，肝癌標(biāo)本中存在SP細(xì)胞的比例與肝癌術(shù)后早期轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)。Chiba等［32］在肝癌細(xì)胞系 Huh7及 PLC/ PRE/5均分離出 SP細(xì)胞，比例分別是 0.25%和0.80%，進(jìn)一步分析了分離出的SP細(xì)胞的特性，發(fā)現(xiàn)他們具有更強(qiáng)的增殖能力和抗凋亡特性。SP細(xì)胞還具有自我更新和多向分化潛能，分離的SP細(xì)胞體外培養(yǎng)能產(chǎn)生SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞。肝癌細(xì)胞系Huh-7及PLC/PRE/5中分離的SP細(xì)胞還具有高成瘤性，皮下注射1×103個(gè)SP細(xì)胞可以使NOD/SCID小鼠皮下成瘤，而注射1×106個(gè)非SP細(xì)胞仍不能成瘤。

但SP方法也不是一個(gè)完美的鑒別肝癌干細(xì)胞的方法，該方法也有局限性，主要原因是染料 Hoechst 33342具有DNA毒性，分選后的細(xì)胞生物學(xué)特性是否發(fā)生改變存有疑問(wèn)［1］。

總之，目前尚未發(fā)現(xiàn)肝癌的特異性的表面標(biāo)志物，但越來(lái)越多的研究證明了肝癌干細(xì)胞的存在。尋找肝癌干細(xì)胞的高度特異性標(biāo)記物將會(huì)進(jìn)一步揭示肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為研究肝癌新的治療方法提供理論依據(jù)。

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R735.7

A

1673－5412(2011)03－0267－03

河南省基礎(chǔ)與前沿計(jì)劃(編號(hào):072300450060);河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃(編號(hào):200703087)

葛麗麗(1981－)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。E-mail:geli.929@163.com

楊小昂(1963－)，男，博士，研究員，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。E-mail:xiaoangyang@163.com

2010－12－29)