劉海燦 萬(wàn)康林

目前,隨著結(jié)核分枝桿菌 (M ycobacterium tuberculosis,M.tubercu losis)H 37Rv、CDC1551、H 37Ra、F11和KZN 1435等菌株全基因組測(cè)序工作的完成,以及新一代核酸測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,使得結(jié)核分枝桿菌研究進(jìn)入新階段,即可以從基因組水平對(duì)其進(jìn)行更深入的研究[1～3]。近年來(lái),有許多從基因水平研究結(jié)核分枝桿的菌種鑒定、菌株分型、分子進(jìn)化以及藥物敏感性檢測(cè)等的文獻(xiàn)報(bào)道[4～10]。本文將就結(jié)核分枝桿菌基因組單核苷酸多態(tài)性 (single nuc leotide po lymorphism s,SNP)的鑒定、檢測(cè)方法及其應(yīng)用研究進(jìn)行綜述。

SNP主要是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的基因組DNA序列多態(tài)性,這種多態(tài)性包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換 (transition)、顛換 (transversion)、插入(insertion)和缺失 (deletion)等 4種形式,但研究中通常認(rèn)為 SNP僅包括轉(zhuǎn)換和顛換兩種形式。SNP可位于基因組的基因編碼區(qū)、非基因編碼區(qū)和基因間隔區(qū),如果 SNP發(fā)生在基因編碼區(qū),但未造成基因編碼的氨基酸序列改變,稱為同義 (synonymous)SNP,若造成基因編碼的氨基酸序列改變或肽鏈被提前終止,則稱為非同義(non-synonymous)SNP。

一、結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP的鑒定方法

結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP有多種鑒定方法,但依據(jù)其基本原理可分為兩大類:一類是DNA測(cè)序相關(guān)方法,主要有全基因組測(cè)序和目的基因片段測(cè)序兩種;另一類是基于 PCR擴(kuò)增的非DNA測(cè)序方法,如實(shí)時(shí)定量 PCR(real-tim e PCR,RT-PCR)、PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài) (PCR-RLFP)、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)、基因芯片(基因探針)檢測(cè)等。

1.基于DNA測(cè)序分析的 SNP鑒定方法:(1)全基因基組測(cè)序分析:隨著核酸測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,全基因組測(cè)序所需時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本不斷降低,完成全基因組測(cè)序的微生物菌株越來(lái)越多,使得我們能夠從全基因組水平研究和分析不同菌株間的差異以及其生物學(xué)意義。例如:Fleischm ann等[1]完成了結(jié)核分枝桿菌 CDC1551株的全基因組測(cè)序工作,并結(jié)合已經(jīng)發(fā)布的 H 37Rv株序列數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)分析。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)基因的 SNP,另外發(fā)現(xiàn)包括 PE/PPE基因家族 (PE/PPE gene fam ily)在內(nèi)的一些基因家族,在全基因組水平有較高水平的同義和非同義 SNP的發(fā)生。(2)目的基因 DNA片段測(cè)序分析:雖然全基因組序列比對(duì)分析可以更全面地發(fā)現(xiàn)不同菌株間的 SNP,但是受到完成全基因組測(cè)序的菌株數(shù)量和費(fèi)用等條件限制,于是人們研究建立了更經(jīng)濟(jì)、高效的目的基因DNA片段測(cè)序分析方法,并廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP鑒定研究。例如:Baker等[11]用 PCR擴(kuò)增了結(jié)核分枝桿菌 7個(gè)管家基因片段 (rpo B、ka t G、oxy R,ahp C,pnc A,rps L,和 gyr A),經(jīng)純化、回收后用AB Ip rism 3700測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,研究這些基因 DNA序列中的 SNP。Talarico等[12]用PCR對(duì) 200株臨床菌株的 PE_PGRS16和 PE_ PGRS26基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序,再與 H37Rv序列進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)基因序列中的 SNP以及其他DNA序列多態(tài)性。

2.其他非DNA測(cè)序的 SNP鑒定方法:非測(cè)序相關(guān)的鑒定方法,主要是與 PCR相結(jié)合進(jìn)行特異性位點(diǎn)的 SNP檢測(cè),通常已確認(rèn)某位置存在 SNP,用來(lái)檢測(cè)該 SNP在檢測(cè)樣本或者群體中的分布情況。常用的方法主要有:(1)RT-PCR:RT-PCR方法是常用的 SNP驗(yàn)證方法,特點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便,但不同研究中建立的 RT-PCR方法稍有差異。例如:Ereqat等[13]用 RT-PCR結(jié)合高分辨率熔解試驗(yàn)的方法,檢測(cè)nar GHJI和 oxy R基因中的 SNP及第 1個(gè)差異區(qū) (region of difference 1,RD 1),快速鑒別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌 (M ycobacterium bovis,M.bovis)。而 Hazbon等[14]采用了發(fā)夾狀引物 (hairp in p rim ers)來(lái)進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn),通過(guò)比較引物與模板互補(bǔ)的反應(yīng)和引物與模板不互補(bǔ)的反應(yīng)的 RT-PCR循環(huán)閾值的差異 (ΔCt),分析不同菌株中的 SNP存在情況。(2)PCR-RFLP:如果 SNP發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上會(huì)導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的增加或消失,利用這一酶切性質(zhì)的改變,將特異的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后,用瓊脂糖凝膠電泳分離,再與正常 PCR產(chǎn)物酶切圖譜進(jìn)行比對(duì)分析即可確認(rèn) SNP的存在情況。例如:Gibson等[15]用 PCR-RFLP方法檢測(cè)Ag85C(Rv0129c)基因第 103位密碼子的 1個(gè) SNP (GAG-GAA),PCR目的片段的大小為 519bp,用M n lI限制性內(nèi)切酶切割,再用 4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離。如果該 SNP存在,僅會(huì)有 461bp和 58bp兩個(gè)條帶;若不存在則會(huì)是 365、96和 58bp 3個(gè)條帶 (電泳圖上看不到 58bp條帶),從而確定該基因中的 SNP存在情況。(3)PCR-SSCP:SSCP測(cè)定中雙鏈 DNA被變性成為單鏈DNA,每條單鏈DNA都基于其內(nèi)部序列不同而呈現(xiàn)出獨(dú)有的折疊構(gòu)象,這些單鏈DNA在非變性條件下用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,由于折疊構(gòu)象和電泳時(shí)溫度的不同而呈現(xiàn)出不同的遷移率和帶型,最后依據(jù)電泳圖譜類型確認(rèn)樣品中的 SNP情況。例如:Torres等[16]用 PCR-SSCP方法檢測(cè)了兩個(gè)利福平和 1個(gè)異煙肼耐藥相關(guān)基因(rpo B、ka t G和 ahp C)的 DNA序列變異情況,確認(rèn)了檢測(cè)樣品中 3個(gè)基因的 SNP發(fā)生情況。(4)基因芯片和基因探針?lè)?由于基因芯片可進(jìn)行高通量 (high -throughput)的實(shí)驗(yàn)操作和分析,近年來(lái)也被用于結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP的驗(yàn)證和分析。例如:Deng和 Xu等[17,18]在研究中采用了不同的芯片檢測(cè)方法,研究利福平耐藥相關(guān)基因 rpo B中的 SNP情況。他們發(fā)現(xiàn)芯片法和DNA測(cè)序確定的 rpo B基因中的 SNP情況具有較高的一致性,可用來(lái)檢測(cè)大量樣品 rpo B基因的 SNP情況。(5)其他 PCR方法:除了上述方法外,還有一些特異性的以 PCR為基礎(chǔ)的 SNP鑒定方法。例如:A lix等[19]在鑒定 Haarlem基因型特異的SNP標(biāo)志時(shí),建立了一種“On/O ff sw ich assay”方法,針對(duì)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)的 m g t C基因 SNP,設(shè)計(jì)了特異性的 PCR擴(kuò)增引物,依據(jù)不同引物能否擴(kuò)增出目的基因片段,驗(yàn)證基因序列中的 SNP情況。M arm e等[20]應(yīng)用熒光光譜分析方法,可快速檢測(cè) PCR產(chǎn)物中目的片段的 SNP情況。

二、結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP的應(yīng)用

上述各種鑒定方法確認(rèn)的結(jié)核分枝桿菌基因組SNP,被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定、菌株分型、藥物敏感性檢測(cè),以及進(jìn)化分析和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等多個(gè)方面。

1.藥物敏感性檢測(cè):目前的研究認(rèn)為,結(jié)核分枝桿菌耐藥性的發(fā)生由多個(gè)基因突變導(dǎo)致,耐藥性相關(guān)基因的 SNP檢測(cè)成為結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性檢測(cè)的重要方法[16,21～24]。如:異煙肼耐藥相關(guān) SNP主要發(fā)生在:ka t G、ahp C、inh A、kas A和 ndh等基因中, ka t G315密碼子 SNP在異煙肼耐藥株有 30%～60%發(fā)生率,而 rpo B526和 rpo B531密碼子的 SNP與結(jié)核分枝桿菌高水平的利福平耐藥相關(guān)[25]。近年來(lái),隨著結(jié)核分枝桿菌二線藥的應(yīng)用和耐藥菌株的出現(xiàn),二線藥耐藥相關(guān)基因的 SNP研究也多有報(bào)道[26]。這些耐藥性相關(guān) SNP的發(fā)現(xiàn)和其檢測(cè)方法的建立,為結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性的快速鑒定奠定了基礎(chǔ),也將為臨床上針對(duì)耐藥性結(jié)核的藥物治療提供支持。

2.菌種快速鑒定:結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌等均可引起人類感染并導(dǎo)致結(jié)核病癥狀,而不同菌種感染臨床上有不同的治療措施,因此,患者感染菌株的快速菌種鑒定也是臨床上采取針對(duì)性治療的迫切需要。Chauhan等[5]研究發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌和卡介苗(bacillusCalm ette-Guérin,BCG)nar K2X基因啟動(dòng)子區(qū)域有 1個(gè) SNP突變,這個(gè) SNP的存在造成兩者與結(jié)核分枝桿菌在缺氧環(huán)境中誘導(dǎo)表達(dá)硝酸/亞硝酸還原酶能力的差異。通過(guò)檢測(cè)這個(gè) SNP可快速、準(zhǔn)確的把結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群 (M.tubercu losis comp lex,M TC)其他成員,包括牛分枝桿菌、卡介苗、非洲分枝桿菌(M.africanum)和田鼠分枝桿菌(M.m icroti)區(qū)分開。

3.分子分型:(1)結(jié)核分枝桿菌北京家族(Beijing fam ily)特異的 SNP標(biāo)志:結(jié)核分枝桿菌北京家族(M. tubercu losis Beijing fam ily)或稱結(jié)核分枝桿菌北京基因型 (M.tubercu losis Beijing geno type)被認(rèn)為具有更高的毒力和傳播能力,有明確的機(jī)制證明其與某些藥物耐藥相關(guān),并被報(bào)道與多起結(jié)核病暴發(fā)相關(guān),是一個(gè)被密切監(jiān)測(cè)的譜系 (lineages),因此,需要建立北京家族快速、準(zhǔn)確的鑒定方法。Homo lka等[7]研究認(rèn)為Rv2629等位基因中的 A 191C突變是北京基因型的生物學(xué)標(biāo)志,A lonso等利用該 SNP標(biāo)志建立了一種與 RT-PCR結(jié)合的高分辨率熔解 (high-resolution m elting)實(shí)驗(yàn),可快速區(qū)分北京家族與非北京家族的菌株。(2)結(jié)核分枝桿菌其他基因型相關(guān)的 SNP標(biāo)志:除了北京型特異的 SNP標(biāo)志,也有文獻(xiàn)報(bào)道其他基因型相關(guān)的特異幾天 SNP標(biāo)志。例如,Chuang等[6]的研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)核分枝桿菌 fad D28基因 507位密碼子存在ATC到ATT的突變,該 SNP的存在可作為結(jié)核分枝桿菌東亞群 (east asia lineage)的特異性標(biāo)志。A lix等[19]通過(guò)對(duì)具有代表性的臨床菌株的研究發(fā)現(xiàn),m g t C基因中的一個(gè) SNP(A 182C)與 Haarlem基因型相關(guān)。

4.進(jìn)化分析和流行病學(xué)研究:(1)進(jìn)化分析:許多研究認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP可被用來(lái)進(jìn)行進(jìn)化分析,特別是其中的同義 SNP,由于研究認(rèn)為其不受選擇壓力的影響,被認(rèn)為是進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌進(jìn)化分析的理想生物學(xué)標(biāo)。例如:Sreevatsan等[27]通過(guò)DNA測(cè)序和與 PCR相結(jié)合的酶切分析,依據(jù) ka t G463和 gyt A95兩個(gè)非同義 SNP突變,成功將屬于M TC的菌株劃分為 3個(gè)基因群 (Group 1/2/3),其中第 1群進(jìn)化上相對(duì)古老,可能與牛分枝桿菌來(lái)自同一進(jìn)化祖先。Fillio l等[28]用 212個(gè) SNP標(biāo)記對(duì)來(lái)源于全球的323株樣品進(jìn)了檢測(cè),并依據(jù) SNP標(biāo)志的發(fā)生情況進(jìn)行聚類分析,將結(jié)核分枝桿菌分為 6個(gè)主要的 SNP聚集群(SNP c luster groups,SCGs)和 5個(gè)亞群 (subgroup)。兩者研究結(jié)果具有很好的一致性,所有的Group 1菌株都分布在 SCG-1、SCG-3a和 SCG-2 3個(gè)群中,所有的 Group 2菌株都分布在 SCG-3b/c、SCG-4和 SCG-5群中,所有的 Group 3菌株都為SCG-6a/b群的菌株。(2)流行病學(xué)研究:結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP,也可用來(lái)對(duì)從同一個(gè)感染鏈條、不同患者體內(nèi)分離的菌株進(jìn)行進(jìn)化分析,進(jìn)而對(duì)整個(gè)感染鏈條進(jìn)行清楚的流行病學(xué)分析。如 Schurch等[29]對(duì)處于一個(gè)確認(rèn)的結(jié)核分枝桿菌傳播和感染鏈條中的患者體內(nèi)分離的菌株,通過(guò)DNA測(cè)序分析及其他鑒定方法,確認(rèn)了包括4個(gè) SNP在內(nèi)的6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。Schurch等研究認(rèn)為這種患者間的菌株進(jìn)化速度和進(jìn)化模式分析表明,結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的分子進(jìn)化是由短時(shí)的變異暴發(fā) (burstsofm utation)和相對(duì)較高的基因組穩(wěn)定性共同決定的,這種進(jìn)化與變異機(jī)制,為抗結(jié)核疫苗和藥物的開發(fā)、應(yīng)用,以及結(jié)核分枝桿菌感染暴發(fā)的管理提供了重要依據(jù)。

三、結(jié)核分枝桿菌基因 SNP研究展望

目前,臨床上相當(dāng)數(shù)量的結(jié)核分枝桿菌感染者,由于受結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)的時(shí)間、技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室硬件等要求的限制,其感染的菌株并沒(méi)有得到及時(shí)的分型鑒定和藥物敏感性檢測(cè),僅能給予經(jīng)驗(yàn)性的治療措施,不利于結(jié)核病 (特別是耐藥性結(jié)核)的治療和控制。但綜上可知,上述 SNP檢測(cè)方法的建立和廣泛應(yīng)用,為快速、高效地進(jìn)行臨床標(biāo)本的菌型鑒定和耐藥性檢測(cè)創(chuàng)造了條件,也給臨床上實(shí)施針對(duì)性的治療方案提供支持。同時(shí),由于其在進(jìn)化分析方面的廣泛應(yīng)用,也為結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化研究和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了有力支持,通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因進(jìn)化的研究和分析,可以更深入了解不同菌株間毒力差異的機(jī)制,為疫苗和抗結(jié)核藥物的開發(fā)提供理論依據(jù);而作為流行病學(xué)監(jiān)測(cè)手段,可以為我們提供明確的傳播和感染模型,為結(jié)核分枝桿菌感染的預(yù)防、控制策略的制訂和實(shí)施提供理論和技術(shù)支持。

結(jié)核分枝桿菌基因組 SNP研究的不斷深入和應(yīng)用的日益廣泛,為我們更深入地進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌相關(guān)研究提供了新的研究方法和研究方向,也為臨床結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷和治療提供了便利,將會(huì)促進(jìn)我們對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)化、致病機(jī)制、流行與傳播特征以及感染后免疫和耐藥發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí),并將為最終實(shí)現(xiàn)結(jié)核病預(yù)防和控制目標(biāo)提供幫助。

1 Fleischmann R D,et a l.W hole-genome comparison ofM ycobacterium tuberculosis clinicaland laboratory strains.JBacterio l,2002,184 (19):5479-5490

2 GutackerM M,eta l.Genom e-w ide analysisof synonymous single nuc leo tide po lymo rphism s inM ycobacterium tubercu losis comp lex organism s:resolution of genetic relationshipsamong closely relatedm icrobial strains.Genetics,2002,162(4):1533-1543

3 Zheng H,eta l.Genetic basisof viru lence attenuation revealed by comparative genom ic analysisofM ycobacterium tubercu losis strain H 37Ra versusH 37Rv.PLoSOne,2008,3(6):e2375

4 W ang H,et a l.Rap idm ethod for identification of six common species ofm ycobacteria based onm u ltip lex SNP analysis.J Clin M icrobio l, 2010,48(1):247-250

5 Chauhan S,A Singh and JS Tyagi.A single-nucleotidemutation in the-10 p romoter region inactivates the narK2X p romoter inM ycobacterium bovis andM ycobacterium bovisBCG and has an app lication in diagnosis.FEMSM icrobiolLett,2010,303(2):190-196

6 Chuang P C,H Y Chen,and R Jou.Single-nuc leotide po lymorphism in the fadD28 gene as a geneticmarker for EastA sia L ineage M ycobacterium tuberculosis.JC linM icrobiol,2010,48(11):4245-4247

7 Homolka S,et a l.Single-nucleotide polymorphism s in Rv2629 are specific forM ycobacterium tuberculosis genotypes Beijing and Ghana butnotassociatedw ith rifamp in resistance.JClinM icrobiol,2009,47 (1):223-226

8 RindiL,et a l.Evolutionary pathway of the Beijing lineage ofM ycobacterium tubercu losis based on genom ic deletions and mutT genes po lymorphism s.Infec tGenet Evo l,2009,9(1):48-53

9 DosVu ltos T,eta l.Evolution and d iversity of clonalbac teria:the paradigm ofM ycobacterium tubercu losis.PLoSOne,2008,3(2):e1538

10 Chakravorty S,et a l.Rifamp in resistance,Beijing-W clade-single nucleotide po lymorphism cluster group 2 phylogeny,and the Rv2629 191-C allele in M ycobacterium tubercu losis strains.JC lin M icrobio l,2008,46(8):2555-2560

11 Baker L,et a l.Silent nuc leotide po lymo rphism s and a phy logeny for M ycobacterium tubercu losis.Em erg InfectD is,2004,10(9):1568-1577

12 Talarico S,et a l.M ycobac terium tubercu losis PE_PGRS16 and PE_ PGRS26 genetic polymo rphism among clinical iso lates.Tubercu losis (Edinb),2008,88(4):283-294

13 Ereqat S,et a l.Rap id differentiation ofM ycobacterium tubercu losis and M.bovisby high-reso lutionm elt curve analysis.JC linM icrobio l,2010,48(11):4269-4272

14 HazbonM H and D A lland.Hairp in p rim ers for simp lified single-nucleotide po lymo rphism analysisofM ycobacterium tubercu losis and othero rganism s.JC lin M icrobio l,2004,42(3):1236-1242

15 Gibson,A L,et a l.App lication of sensitive and specificmolecular m ethods to uncover global dissem ination of themajor RDRio Sublineage of the Latin American-M editerraneanM ycobacterium tuberculosis spoligotype fam ily.JC linM icrobiol,2008,46(4):1259-1267

16 TorresM J,et a l.Rifamp in and isoniazid resistance associatedmutations inM ycobacterium tubercu losis clinical isolates in Seville,Spain. Int JTuberc Lung D is,2002,6(2):160-163

17 Deng J Y,et a l.O ligonuc leotide ligation assay-based DNA chip for m ultip lex detection of single nuc leotide polymorphism.B iosensB ioelectron,2004,19(10):1277-1283

18 Xu C,eta l.On-chip ligation ofmultip lexing p robe-pairs for identifying pointmutations out of dense SNP loci.B iosens B ioelectron, 2008.24(4):818-824

19 A lix E,SGodreuiland A B B lanc-Potard.Identification of a Haarlem genotype-specific single nucleotide polymorphism in themgtC virulence gene of M ycobacterium tuberculosis. J C lin M icrobiol, 2006,44(6):2093-2098

20 M arm eN,eta l.Identification of single-pointm u tations inm ycobacterial16S rRNA sequences by confocal single-mo lecu le fluorescence spectroscopy.Nucleic A cidsRes,2006,34(13):e90

21 W u X,eta l.M o lecu larm echanism sof d rug resistance inM ycobacterium tubercu losis c linical iso lates.Chin M ed J(Engl),1999,112 (6):524-528

22 Rom ero B,et a l.D rug suscep tibility of Spanish M ycobacterium tubercu losis comp lex iso lates from anim als.Tubercu losis(Edinb),2007, 87(6):565-571

23 Cardoso R F,et a l.Sc reening and characterization ofm u tations in isoniazid-resistantM ycobacterium tubercu losis isolatesobtained in B razil.Antim icrob AgentsChemother,2004,48(9):3373-3381

24 Tracevska T,et a l.M utations in the rpoB and katG genes leading to d rug resistance inM ycobacterium tuberculosis in Latvia.JClinM icrobiol,2002,40(10):3789-3792

25 Johnson R,et a l.D rug resistance inM ycobacterium tubercu losis.Curr IssuesMo lB iol,2006,8(2):97-111

26 Ram irezM V,et a l.Rap id detection ofmultidrug-resistantM ycobacterium tubercu losis by use of real-time PCR and high-reso lution meltanalysis.JC linM icrobio l,2010,48(11):4003-4009

27 Sreevatsan S,eta l.Restricted structuralgene polymorphism in theM ycobacterium tuberculosis comp lex indicatesevo lutionarily recentglobal dissem ination.Proc Natl Acad SciU SA,1997,94(18):9869-9874

28 Fillio l I,et a l.Globalphylogeny ofM ycobacterium tuberculosis based on single nuc leotide polymorphism(SNP)analysis:insights into tuberculosis evo lution,phylogenetic accuracy of otherDNA fingerp rinting system s,and recommendations for am inimal standard SNP set.J Bacteriol,2006,188(2):759-772

29 Schurch A C,eta l.The tempo andmode ofmolecularevo lution ofM ycobacterium tuberculosis at patient-to-patient scale.Infect Genet Evol,2010,10(1):108-114