瑪依拉 許黎黎 鮑琳琳 呂 琦 鄧 巍 李楓棣 占玲俊 朱 華 馬春梅 秦 川

2009年 4月始發(fā)于墨西哥和美國的流感,是由一種新型的A(H 1N 1)甲型流感病毒引起的急性熱性呼吸道傳染病,短短數(shù)月,疫情蔓延全球?；蚍治霭l(fā)現(xiàn),新型A(H 1N 1)甲型流感病毒中 6個基因片段來源于豬流感病毒的“三源重配株”,2個基因片段來源于歐亞豬流感病毒[1]。甲型 H 1N 1流感大多數(shù)臨床表現(xiàn)為上呼吸道疾病,少數(shù)繼發(fā)嚴重肺炎、急性呼吸窘迫綜合征,個別的突發(fā)死亡病例,是由于機體缺乏對流感病毒的免疫力[2]。1918年西班牙流感和1968年香港流感,第 2波的發(fā)病比第 1波發(fā)病嚴重,出現(xiàn)此現(xiàn)象的一種可能的解釋是流感病毒適應了宿主,導致出現(xiàn)強毒力,這種適應性發(fā)生的原因是流感病毒間的基因重組或突變[3]。流感病毒的毒力,致病性,宿主范圍由多種因素決定,其中決定宿主特異性的主要原因包括糖蛋白 HA和NA與宿主表面唾液酸受體的親和力[4]。PA、PB1、PB2 3種聚合酶蛋白關(guān)鍵位點的變異在 H5N 1和 H 7N7及 1918年H 1N 1流行中占有重要地位[5]。非結(jié)構(gòu)蛋白 PB1-F2和NS1的多態(tài)性在H5N 1和1918年H1N 1暴發(fā)中也發(fā)揮一定作用[6]。序列分析顯示 2009年新型 A (H 1N 1)甲型流感病毒缺少在禽類和哺乳動物中強致病性因素,如 HA裂解位點處的多個堿性氨基酸, PB2聚合酶蛋白第 627位賴氨酸等[7,8]。A(H1N 1)甲型流感病毒的毒力機制是由多因子決定的,仍需深入研究。

本實驗選擇 3種毒株,研究 2009年 A(H1N 1)甲型流感病毒基因序列多態(tài)性對病毒復制及毒力的影響。病毒復制分析在MDCK細胞中進行,毒力和致病性實驗在BALB/c小鼠體內(nèi)進行。我們希望本研究能進一步了解 2009年A(H 1N 1)甲型流感病毒基因多態(tài)性在病毒復制,毒力,致病性和分子演變中的重要作用。

材料與方法

1.病毒株:3種毒株的背景信息,A/California/04/2009為世界范圍內(nèi)首例A(H 1N 1)甲型流感病毒分離株,A/Sichuan/ 1/2009從中國第 1例甲型流感病毒感染病人身上分離而來,此病人系 2009年 5月從美國回國。A/Beijing/3/2009感染患者有輕微癥狀。3種毒株分別在MDCK細胞中傳代培養(yǎng),根據(jù) Reed-M uench方法計算病毒的 TC ID50[9]。體外細胞感染實驗及體內(nèi)動物攻毒實驗都按照世界衛(wèi)生組織指導原則在BSL-3實驗室中進行。

2.方法:(1)病毒感染細胞:MDCK細胞在含有 10%胎牛血清的DM EM(Invitrogen公司)中培養(yǎng),102TC ID50病毒液接種于單層培養(yǎng)MDCK細胞的 35mm培養(yǎng)板上,37℃吸附 60m in,加入 3m l無血清培養(yǎng)基,含 TPCK胰蛋白酶 (0.5μg/m l)(Sigm a公司)和抗生素 (Sigm a公司)。分別在感染細胞后 0,12, 24,36,48,56,72,96h收集 100μl病毒上清液,3000 r/m in離心10m in。(2)病毒感染小鼠:實驗在本所的BSL-3實驗室中進行。SPF級 5周齡雌性BALB/c小鼠(由醫(yī)科院實驗動物研究所提供),每組 23只,分為組 1(10只)及組 2(13只)將小鼠按0.02m l/g比例肌內(nèi)注射三溴乙醇麻醉后,通過滴鼻途徑接種小鼠,3種毒株病毒液稀釋為 106TC ID50,每只小鼠的接種劑量為 50μl。組 1小鼠連續(xù)觀察 14天記錄臨床表現(xiàn)和病死率。組 2小鼠在攻毒后第 5天安樂后取肺組織,其中 10份進行核酸定量和病理學檢察,另 3份進行病毒效價的檢測。(3)Real -tim e PCR:小鼠肺組織研磨成勻漿,從上清液中提取 RNA (Q iagen公司),溶于 30μlDEPC水中,保存于 -80℃。取 8μl RNA進行反轉(zhuǎn)錄 cDNA的合成,加入到總體積為 20μl,含有200U Superscrip tⅢ反轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen公司)的反應體系中。實時熒光定量 PCR檢測體系為 20μl,包括 10μl 2×SYBR Green熒光染料M ix(AB I公司),各 1μl 10μmo l/L的正向和反向引物(SW-HA F786:5′-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3′,SW-HAR920:5′-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3′),2μl cDNA模板和 6μl無 RNA酶的水。熱循環(huán)條件,94℃ 3m in,94℃30s,58℃30s,72℃30s,35個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后讀取熒光值。(4)血凝實驗:MDCK細胞感染病毒后,上清液中的病毒效價用 1%火雞血細胞作為指示劑進行血凝實驗檢測。50μl病毒液與 1%火雞紅細胞懸液等體積混合,室溫靜置 30m in。血凝效價的判定以出現(xiàn)凝集的最高稀釋度為終點,其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的血凝效價。(5)病理學檢查:迅速取出安樂死后小鼠的肺組織,10%甲醛固定 4℃,過夜。石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色,光鏡下觀察病理變化 (OLYMPUSBX-50,放大倍數(shù) 40)。(6)基因測序與比對分析:3種病毒的基因片段利用高保真 PCR擴增(KOD p lus),擴增產(chǎn)物純化后測序。利用 CLUSTALW(version 1.83)軟件對 3種毒株的基因序列進行比對。(7)數(shù)據(jù)分析:病毒載量和效價的數(shù)據(jù)處理運用 SPSS 11.5軟件單因素方差分析法。

結(jié) 果

1.細胞內(nèi)病毒復制力比較:在病毒感染MDCK細胞 48h后 A/Sichuan/1/2009病毒株的病毒 RNA載量顯著高于其他兩株 (P<0.05),而 A/California/ 04/2009和 A/Beijing/3/2009兩種毒株的病毒 RNA載量沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖 1)。

圖1 細胞中病毒RNA載量

2.小鼠體內(nèi)病毒毒力比較:為進一步體內(nèi)比較 3種病毒株的毒力,我們選擇BALB/c小鼠作為動物模型,通過鼻內(nèi)接種病毒液,觀察發(fā)病情況,病死率,及肺組織測定病毒 RNA載量和效價,80%的小鼠在接種 A/Sichuan/1/2009病毒后死亡,A/California/04/ 2009毒株感染后的存活率是 60%,A/Beijing/3/2009病毒株感染后沒有出現(xiàn)死亡小鼠 (圖 2)。A/Sichuan/1/2009株感染后,小鼠的平均存活天數(shù)是 6.8天,是 3種毒株中最低組(圖 3)。

為進一步比較 3種毒株的毒力及致病性,我們檢測了攻毒后小鼠肺組織的載毒情況,主要指標是檢測感染后 5天,當病毒擴散達高峰時的病毒 RNA載量和病毒效價。接種 A/Sichuan/1/2009株病毒液的小鼠肺組織病毒 RNA載量顯著高于其他兩種毒株 (P< 0.05),病毒效價較其他兩種毒株高(圖 4、圖 5)。

而且,通過切片、HE染色鏡下觀察接種病毒后 5天小鼠的肺組織病理變化,3種毒株感染小鼠的肺組織均有充血、出血、水腫、滲出等炎癥病理變化。接種A/Sichuan/1/2009病毒株的小鼠,100%肺組織出現(xiàn)病變,接種 A/Califo rnia/04/2009病毒株的小鼠85%肺組織出現(xiàn)病變,接種 A/Beijing/3/2009病毒株的小鼠肺組織出現(xiàn)病變的發(fā)生率是 60%(圖 6、圖7)。

圖 6 小鼠肺臟 HE病理組織切片(×40)

圖 7 感染小鼠肺組織病變范圍

3.病毒基因組序列分析:通過高保真 PCR獲得3種毒株的全基因組片段并測序,與其他兩種毒株相比 A/Sichuan/1/2009株 HA蛋白 32位點處,亮氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?。同時,PA蛋白 343位點處丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸,PB1蛋白 353位點和 566位點處分別是賴氨酸突變?yōu)榫彼?蘇氨酸突變?yōu)楸彼?PB2蛋白 471位點處蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼帷?/p>

討 論

抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變引起流感病毒的暴發(fā)和流行。2009年新型A(H1N 1)甲型流感病毒引起較溫和的疾病和相對低的致死率,但是也出現(xiàn)個別嚴重的致死病例。病毒基因組中關(guān)鍵區(qū)域的突變是引起流感病毒株毒力增強及導致大流行的主要原因之一[10]。在本研究中,體內(nèi)和體外實驗證明全基因組序列的多態(tài)性是決定 2009年A(H1N 1)甲型流感病毒復制能力,毒力,及致病性的關(guān)鍵因素。

在感染 MDCK細胞 48h后,A/Sichuan/1/2009株相較另外兩株顯示了顯著性增強的復制能力,血凝實驗顯示 A/Sichuan/1/2009株呈現(xiàn)最高的病毒效價。在BALB/c小鼠體內(nèi)實驗中,A/Sichuan/1/2009株感染的小鼠存活率最低,存活天數(shù)最短,肺組織中RNA的載量及病毒效價最高,肺組織出現(xiàn)最嚴重的病理改變。實驗證實在體外MDCK細胞中和BALB/ c小鼠體內(nèi) A/Sichuan/1/2009株均具有最強的復制能力及致病性。

基因序列分析發(fā)現(xiàn) A/Sichuan/1個/2009株有 5個特異突變位點。HA蛋白中 32位點L突變?yōu)?I,PA蛋白中 343位點的A突變?yōu)?T,PB1蛋白中 353位點的 K突變?yōu)?R,566位點的 T突變?yōu)?A,PB2蛋白中471位點的 T突變?yōu)镸。結(jié)構(gòu)分析顯示 32位的氨基酸并沒有參與 HA蛋白的受體結(jié)合和細胞膜融合過程,所以 HA蛋白中 32位點亮氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岵皇嵌玖υ鰪姷臎Q定因素[11]。聚合酶基因與病毒的毒力密切相關(guān)。PA蛋白第 515位點的突變在 H 5N 1流感的暴發(fā)流行中起關(guān)鍵作用[12]。反向遺傳學研究顯示 PB2基因中 627位點 E突變?yōu)?K和 701位點D突變?yōu)镹對流感病毒在哺乳動物中的適應性增強有重要作用[8]。PB2基因中第 701氨基酸位點在鴨源H 5N 1流感復制中起重要作用,其突變會導致小鼠的致死效應[13]。同樣,PB 2氨基酸殘基的變異會增加H 7N 1鳥源流感在小鼠模型中的致死率[14]。最近的研究顯示,PB2蛋白第 271位點 T突變?yōu)?A,會提高聚合酶的酶活從而使病毒在人體內(nèi)更快的復制[15]。有研究報道,由 PB 1基因閱讀框移碼翻譯編碼的約90個氨基酸的 PB1-F2,在毒力增強過程中起重要作用,在小鼠模型中 PB 1-F2蛋白第 66位點的絲氨酸和高致病性有關(guān)。以上資料顯示聚合酶復合體與病毒的高毒力及致病性密切相關(guān),A/Sichuan/1/2009株聚合酶復合體中 4個殘基的突變在 2009年新型A (H 1N 1)甲型流感病毒毒力中起重要作用。然而,究竟是聚合酶復合體中 1個,2個或者是 4個氨基酸的同時替換,才導致最終毒力的增強,還需要進一步的反向遺傳學及單突變感染實驗的驗證。

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn) 2009年新型 A(H 1N 1)甲型流感病毒基因多態(tài)性對其在MDCK細胞內(nèi)的復制能力和BALB/c小鼠模型體內(nèi)的毒力及致病性中起重要作用。PA蛋白中 343位點的 A突變?yōu)?T, PB 1基因中 353位點的 K突變?yōu)?R,566位點的 T突變?yōu)锳,PB 2基因中 471位點的 T突變?yōu)镸,這些位點的突變與病毒毒力的增強密切相關(guān)?；蚪M內(nèi)關(guān)鍵位點的變異對 2009年新型 A(H 1N 1)甲型流感病毒的復制、毒力致病性的影響尚需進一步研究。

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