鄔瑞光，周洪偉，張小華，吳富根

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102;2.清華大學(xué)，生命有機磷化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，北京 100084)

丹皮酚(paeonol，結(jié)構(gòu)式見圖1)是中藥牡丹皮和中藥徐長卿的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗變態(tài)反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)痛的藥理作用，現(xiàn)已廣泛用于治療濕疹、蕁麻疹、牛皮癬、銀屑病等常見皮膚?。?］。丹皮酚在水中的溶解度很低，且性質(zhì)不穩(wěn)定、易揮發(fā)，將其制成脂質(zhì)體可有效地解決難溶性問題，并能提高藥物的穩(wěn)定性、靶向性和增強療效［2］。目前，對丹皮酚脂質(zhì)體的研究大都集中在脂質(zhì)體的制備方法、包封率以及微觀形態(tài)等方面，丹皮酚與脂質(zhì)體相互作用機制的的研究未見報道。脂質(zhì)體膜是生物膜的模型膜，一般是由磷脂等脂質(zhì)分子通過自組裝形成的以雙分子層為單位的多層膜(multibilayers)，脂質(zhì)體膜中常用的磷脂是DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿，是卵磷脂的主要成分，結(jié)構(gòu)式見圖1)。隨著溫度的變化，脂質(zhì)體膜可能呈現(xiàn)晶體相、凝膠相及液晶相等不同的相態(tài)［3］。在加熱的情況下脂質(zhì)體膜的相變稱為熱致相變。本實驗通過研究丹皮酚與脂質(zhì)體膜作用后脂質(zhì)體膜的熱致相變情況來揭示丹皮酚與脂質(zhì)體的相互作用機制。

圖1 丹皮酚(a)和DPPC(b)的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DSC 821e(瑞士梅特勒－托利多公司):采用高靈敏度傳感器HSS7，溫度誤差為±0.1℃，熱功率誤差為±0.01mW。實時同步輻射X光衍射實驗在中科院高能物理研究所北京同步輻射實驗站(BSRF)進行。

1.2 試藥 DPPC(美國Sigma公司，純度＞99%);丹皮酚(中國食品藥品檢定研究院，批號 110708－200506);氯仿、甲醇(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹皮酚脂質(zhì)體的制備 參照文獻［4］的方法制備丹皮酚脂質(zhì)體:按計量比稱取丹皮酚和DPPC，溶解于氯仿和甲醇混合溶劑中(氯仿和甲醇的體積比為9∶1)，30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，至燒瓶內(nèi)壁形成一薄層脂膜，通N210min繼續(xù)除去殘留溶劑;加入超過量的Tris－HCl緩沖液;N2保護下置于60℃水浴10min，旋渦混合1min，低溫 N2保護下間斷性超聲15min，水?。瓬u旋－超聲循環(huán)三次，至體系均勻分散。

2.2 DSC實驗 實驗氣氛為N2，以空白坩堝做參比。升溫速率一般為0.5℃/min，以保證樣品在升溫過程中處于相平衡的狀態(tài)，個別樣品還采用5℃/min的快速升溫速率以確定該樣品是否發(fā)生前相變，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度的丹皮酚/DPPC脂質(zhì)體的DSC譜

2.3 同步輻射XRD實驗 實驗使用可以程序控溫的Linkam變溫附件。衍射波長為1.54?，樣品與檢測器的距離為720mm，曝光時間為120s，以山崳酸銀為標準樣品進行數(shù)據(jù)校正。衍射圖像用Fit2D軟件處理以得到衍射強度與倒置間距之間的二維衍射曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 丹皮酚濃度為33mol%的脂質(zhì)體在升溫過程中的小角X光衍射圖譜

3 討論

根據(jù)McMullen等的方法，以吸熱峰的峰頂溫度(peak temperature)作為相變溫度［5］。由圖 2 可見，純DPPC脂質(zhì)體的DSC曲線顯示了兩個吸熱峰，36℃左右的吸熱峰為DPPC分子的前相變，由層狀凝膠相轉(zhuǎn)變?yōu)椴▌幽z相(Lβto Pβ);42℃左右的吸熱峰為DPPC分子的主相變，由波動凝膠相變?yōu)橐壕?Pβto Lα)。這一結(jié)果與文獻報導(dǎo)的純DPPC脂質(zhì)體的相變溫度一致［6］。當?shù)てし釉谥|(zhì)體中的濃度逐漸增大到15mol%時，DPPC分子的主相變溫度逐漸降低，丹皮酚摩爾百分比分別為5mol%，15mol%時，DPPC分子的主相變溫度分別為39℃，38℃。由于主相變反映的是DPPC分子疏水尾鏈的排列情況，所以這一結(jié)果說明，丹皮酚分子進入了DPPC雙層膜的疏水區(qū)域，與DPPC分子的尾鏈發(fā)生了相互作用，降低了DPPC疏水尾鏈的有序性，增大了其流動性，故而主相變溫度降低。圖2表明，0.5℃/min的升溫速率沒有檢測到5mol%和15mol%這兩個樣品的前相變信號，說明這兩個樣品沒有前相變，只有主相變。為了確保這一結(jié)論的可靠性，本實驗又以5℃/min的升溫速率對這兩個樣品進行了快速升溫實驗，如圖2中各自慢速升溫曲線上方的短直線所示。結(jié)果表明，快速升溫也沒有檢測到這兩個樣品的前相變。說明這兩個濃度下丹皮酚的加入使DPPC雙層膜在室溫就已經(jīng)是波動凝膠相了。文獻也曾報導(dǎo)在DPPC雙層膜中加入一些調(diào)節(jié)流動性的物質(zhì)后前相變消失的例子，如在DPPC多層膜中加入一定濃度范圍的豆固醇［6］、膽固醇［7］和吡柔比星［8］等分子后前相變消失。

當?shù)てし拥哪柊俜直冗_到33mol%時，DPPC雙層膜出現(xiàn)了3個吸熱峰，如圖中編號a，b，和c所示。這說明此時丹皮酚分子誘導(dǎo)DPPC雙層膜發(fā)生了分相(phase separation)現(xiàn)象。此時雙層膜中有兩個相，分別是丹皮酚濃度很低的相(paeonol－poor phase)和丹皮酚濃度很大的相(paeonol－rich phase)。吸熱峰a和吸熱峰b的面積都很小，根據(jù)相圖的杠桿原理，應(yīng)該歸屬于丹皮酚濃度很低的相的吸熱峰，分別對應(yīng)該相的前相變和主相變，因為丹皮酚濃度很小的時候樣品接近于純DPPC，所以可以檢測到前相變和主相變;吸熱峰c的面積較大，應(yīng)該歸屬于丹皮酚濃度很大的相的吸熱峰，為主相變吸熱峰，因為前文已述及丹皮酚濃度很大時檢測不到前相變，只能檢測到主相變，這3個吸熱峰所代表的相變情況從同步輻射X光衍射實驗結(jié)果得到驗證。

圖3中S值在0.15附近的衍射峰為第一級衍射峰(first order)，s值在0.3左右的衍射峰為第二級衍射峰(second order)。第一級衍射峰除35℃所對應(yīng)的曲線外都明顯由兩個峰組成，分別是s值較小的尖峰和s值較大的寬峰，這說明樣品在35℃以下都分為兩相，35℃時兩相都轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕?，故表現(xiàn)為一個峰，這與圖2結(jié)果一致。尖峰的強度大，其峰位置在33℃ ～35℃之間有明顯右移現(xiàn)象，符合磷脂雙分子層主相變小角X光衍射譜峰的移動規(guī)律［9］，說明該相由波動凝膠相變?yōu)橐壕?Pβto Lα)，對應(yīng)于圖2中的峰c;寬峰的強度小，其峰位置在20℃ ～25℃和27℃ ～29℃之間分別有明顯左移和右移現(xiàn)象，分別符合磷脂雙分子層前相變和主相變小角X光衍射譜峰的移動規(guī)律［9］，分別代表該相由層狀凝膠相轉(zhuǎn)變?yōu)椴▌幽z相(Lβto Pβ)和由波動凝膠相轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕?Pβto Lα)，分別對應(yīng)于圖2中的峰a和峰b。既然丹皮酚濃度很低的相可以檢測到前相變，說明其濃度接近于0(即幾乎為純DPPC)，這樣富含丹皮酚的相中丹皮酚的濃度就應(yīng)該接近于體系的濃度，即33mol%，也就是說丹皮酚/DPPC脂質(zhì)體膜分相后富含丹皮酚的相態(tài)中丹皮酚和DPPC的摩爾數(shù)之比為1∶2，這樣就可以將脂質(zhì)體中丹皮酚和DPPC的作用機制解釋為在DPPC雙層膜中每2個DPPC分子中間插入1個丹皮酚分子，當然這一結(jié)論還需要進一步通過光譜等實驗手段進行驗證。

本實驗以DPPC雙層膜模擬生物膜，用DSC和同步輻射X光衍射兩種方法研究了丹皮酚和生物膜相互作用后生物膜的熱致相變情況。結(jié)果表明，與丹皮酚相互作用后，生物膜的主相變溫度變化較大，說明丹皮酚與生物膜的疏水尾鏈發(fā)生了相互作用;結(jié)果還表明，較大濃度的丹皮酚可以誘導(dǎo)生物膜發(fā)生分相現(xiàn)象，且分相后富含丹皮酚的相態(tài)中丹皮酚和DPPC的摩爾數(shù)之比為1∶2，可以將脂質(zhì)體中丹皮酚和DPPC的作用機制解釋為在DPPC雙層膜中每2個DPPC分子中間插入1個丹皮酚分子。

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