王炎強， 劉洪梅， 王紅軍， 曹俊平， 肖成華， 高殿帥

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是繼阿爾茨海默病之后最常見的進行性神經(jīng)退行性運動障礙性疾病，以泛素蛋白酶體系統(tǒng)障礙、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激等各種病理狀態(tài)導(dǎo)致特發(fā)性黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性，Lewy小體形成為主要特征。目前臨床上尚無明確地有效控制與逆轉(zhuǎn)病程的措施，且患病率日趨增高，已引起醫(yī)學(xué)科研人員的廣泛關(guān)注。因此，尋找延緩或阻止病變發(fā)展的替代治療成為當(dāng)前亟待解決的核心問題之一。國內(nèi)外學(xué)者證實鋰鹽除了以其獨特的藥理學(xué)特性在精神、癲癇疾病等方面取得良好的效益之外還且具有神經(jīng)營養(yǎng)與保護作用。本研究以1-甲基4-苯基-1，2，3，-6四氫吡啶(MPTP)構(gòu)建帕金森小鼠模型為平臺，通過觀察氯化鋰(LiCl)對其行為學(xué)特征、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變化的影響，探討LiCl對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的保護作用，從而為PD病因、發(fā)病機制研究及臨床防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 實驗小鼠，7～8w齡，體重20～25g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。氯化鋰、MPTP、小鼠源TH抗體、兔源CaBP抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的生物素卵白素復(fù)合物、生物素結(jié)合的羊抗小鼠單克隆抗體(二抗)、堿性磷酸酶結(jié)合的山羊抗兔小鼠IgG購于Sigma公司;封閉用羊血清原液，購于北京中山公司。

1.2 PD模型的制備與分組 實驗小鼠隨機分為MPTP組、NS(生理鹽水)組、LM(LiCl+MPTP)組、PM(PBS+MPTP)組，每組12只。NS組注射同等劑量的NS，其他3組均腹腔注射MPTP 30mg/kg，連續(xù)給藥5d。其中:PM、LM組在小鼠腹腔注射MPTP第2天分別腹腔注射PBS(30mg/kg)與LiCl(30mg/kg)，連續(xù)4d，注射后進行行為學(xué)測定。

1.3 行為學(xué)檢測 (1)一般行為學(xué)與震顫麻痹評分觀察:給藥后立即觀察行為變化，無任何癥狀0分;間斷性細小震顫，但活動自如1分;頻繁性震顫，后肢僵直，顫尾，活動逐漸受限2分;連續(xù)性震顫，四肢僵硬，吞咽活動頻繁，活動受限3分;全身麻痹而死亡4分。(2)自主活動計數(shù):自制30cm×30cm×15cm的有機玻璃盒，底部刻出6cm×6cm的格子，在安靜光線較暗的環(huán)境中檢測，適應(yīng)環(huán)境10min后，計數(shù)5min內(nèi)小鼠移動的格子數(shù)和站立的次數(shù)，連續(xù)測5次取平均值。(3)滾軸實驗:在滾軸上保持平衡并連續(xù)運動，直徑6cm，轉(zhuǎn)速20r/min，適應(yīng)5次后，每次間隔1min，連續(xù)測5次取平均值。(4)游泳實驗:將受試小鼠放入20cm×30cm×20cm的有機玻璃水箱中，水深10cm，水溫為22℃ ～25℃。在1min內(nèi)能連續(xù)不斷游泳記3.0分;大部分時間游泳僅偶爾漂浮記2.5分;漂浮時間占整個受試時間50%以上記2.0分;偶爾游泳記1.5分;偶爾用后肢游動并漂浮在一邊記1.0分。每次檢測間隔 1min，共檢測5次取平均值［1］。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 實驗小鼠用水合氯醛腹腔麻醉后，4% 多聚甲醛灌注、取腦、后固定、石蠟包埋及連續(xù)腦組織冠狀切片(厚6μm)，切片脫蠟至水，微波修復(fù)，0.5%正常羊血清封閉，37℃，30min。依次加入小鼠抗TH抗體或抗CaBP抗體、生物素結(jié)合的羊抗小鼠Ig、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的生物素卵白素復(fù)合物。DAB分別對CB和TH顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。參照Paxions and Wastson(1986)圖譜，將每個中腦組織切片從嘴側(cè)至尾側(cè)分為前、中、后3個區(qū)域。任意選擇帶有明顯核仁的有清晰輪廓的TH+神經(jīng)元或CB+神經(jīng)元作為測量對象，測定單位面積內(nèi)陽性細胞數(shù)平均數(shù)。

1.5 Western blot法檢測 模型制備1w后，將與免疫組化同批同組小鼠快速斷頭取腦，分離右側(cè)黑質(zhì)，立即置液氮凍存?zhèn)溆?。液氮中取出黑質(zhì)加1.5 ml勻漿緩沖液，用Teflon勻漿器高速勻漿離心取上清夜，均在冰水浴中進行。按改良Lowry方法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測定蛋白后分裝，置－80℃冰箱待用。按Hu等方法，等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至NC上。轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)3%BSA封閉后加入一抗TH或CB，4℃過夜。用洗滌液洗膜，加入相應(yīng)二抗(堿性磷酸酶結(jié)合的羊抗小鼠)，37℃2h洗膜，以NBT/BCIP顯色，反應(yīng)達到要求后，流水洗滌終止反應(yīng)。所得膜可直接用圖像處理儀(Gene Company)掃描，ImageJ軟件進行圖像處理［2］。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測定 小鼠在 MPTP注射后3～5min出現(xiàn)豎毛、豎尾、弓背、運動減少、步態(tài)不穩(wěn)、下頜和肢體尾部震顫等急性反應(yīng)。1h內(nèi)行為學(xué)改變較明顯，24h后恢復(fù)正常。MPTP組小鼠震顫麻痹評分、移動格子數(shù)、站立次數(shù)、滾軸實驗、游泳能力都顯著低于NS組(P＜0.05)，LM組小鼠震顫麻痹評分、移動格子數(shù)、站立次數(shù)、滾軸實驗、游泳能力都顯著高于 PM 組 (P ＜0.05)，(見表1)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 與NS組相比，MPTP組黑質(zhì)TH、CB陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，差異有顯著性(P＜0.01)，神經(jīng)元呈帶狀分布僅存輪廓，陽性纖維、細胞稀疏，排列紊亂，胞體面積變小，胞漿染色變淡，突起細短、稀疏。TH、CB陽性神經(jīng)元細胞突起的長短、數(shù)量、胞體的面積等形態(tài)學(xué)方面也有明顯的差別。LM組和PM組比較，LM組黑質(zhì)TH、CB陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，差異有顯著性(P＜0.01)，神經(jīng)元呈簇帶狀分布，比較密集，表達增多，陽性纖維、細胞濃密，排列整齊，胞體面積變大，胞漿染色深，突起粗長、濃密。胞體的數(shù)目、面積、突起的長度與突起數(shù)目也明顯增多(見表2、見圖1～圖4)。

2.3 Western blot結(jié)果 腹腔注射LiCL和PBS后，同側(cè)黑質(zhì)TH蛋白、CB蛋白表達水平LM組與PM組相比差異有顯著性(P＜0.05)(見表2、見圖5)。

表1 各組行為學(xué)評分比較()

表1 各組行為學(xué)評分比較()

與NS組比較*P＜0.05;與PM組比較#P＜0.05

行為學(xué)檢測組別震顫麻痹評分 站立次數(shù) 移動格子數(shù) 滾軸實驗 游泳實驗NS組MPTP組PM組LM組0.00 ±0.00 2.23 ±1.25*2.21 ±1.26 1.62 ±0.94#24.61 ±7.85 15.52 ±5.47*14.81 ±6.13 20.72 ±7.68#73.54 ±8.72 53.26 ±6.32*52.83 ±7.14 67.82 ±9.31#22.63 ±5.70 11.48 ±4.31*12.72 ±3.87 16.51 ±4.62#2.96 ±1.41 1.51 ±0.57*1.67 ±0.63 2.42 ±1.15#

表2 各組黑質(zhì)陽性細胞數(shù)與蛋白表達比較()

表2 各組黑質(zhì)陽性細胞數(shù)與蛋白表達比較()

與NS組比較*P＜0.01;與PM組比較#P＜0.05

黑質(zhì)TH、CB蛋白表達組別黑質(zhì)陽性細胞數(shù)TH+ CB +TH CB NS組MPTP組PM組LM組67.53 ±10.76 34.85 ±8.62*30.52 ±5.30 63.74 ±12.48#36.41 ±6.64 19.76 ±5.83*21.26 ±6.14 56.47 ±7.51#1.23 ±0.21 1.00 ±0.00*1.00 ±0.00 1.98 ±0.57#1.15 ±0.17 1.00 ±0.00*1.00 ±0.00 1.87 ±0.76#

圖1 MPTP組、NS組同側(cè)黑質(zhì)處TH免疫組織化學(xué)染色

圖2 MPTP組、NS組同側(cè)黑質(zhì)處CB免疫組織化學(xué)染色

圖3 PM組、LM組同側(cè)黑質(zhì)處TH免疫組織化學(xué)染色

圖4 PM組、LM組同側(cè)黑質(zhì)處CB免疫組織化學(xué)染色

圖5 LM組、PM組同側(cè)黑質(zhì)TH、CB蛋白表達的比較

3 討論

多巴胺能神經(jīng)細胞的變性是PD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，PD病因、發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚不完全明確。因此，建立穩(wěn)定的模擬人類PD病理、生化、行為學(xué)改變的PD動物模型，有助于其發(fā)病機制、病理過程、干預(yù)治療的研究。MPTP對多巴胺能系統(tǒng)的損害具有高度選擇性，其制備模型的可行性及機制本課題已有報道［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在 MPTP注射后 3～5min出現(xiàn)豎毛、豎尾、弓背、運動減少、步態(tài)不穩(wěn)、下頜和肢體以及尾部震顫等急性反應(yīng)，1h內(nèi)行為學(xué)改變較明顯，24h后完全恢復(fù)。隨用藥次數(shù)增加，急性反應(yīng)減輕，而24h后運動減少、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、反應(yīng)遲緩等運動障礙程度增加，癥狀持續(xù)時間延長。豎毛、豎尾可能與體內(nèi)兒茶酚胺如去甲腎上腺素與5-羥色胺變化相關(guān);震顫可能與殘存DA能神經(jīng)元的多巴胺轉(zhuǎn)換率及突觸后受體的暫時代償性改變相關(guān)。

自主活動計數(shù)、滾軸實驗、游泳實驗是目前 PD小鼠行為學(xué)檢測最常用的方法，能相對準(zhǔn)確地反映其運動減少、遲緩、協(xié)調(diào)性等行為學(xué)改變。TH主要存在于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)，是DA合成的關(guān)鍵酶和DA能神經(jīng)元的標(biāo)志酶。而含CB的DA能神經(jīng)元主要存在于黑質(zhì)致密部，尤其背外側(cè)部，具有抗變性作用，能夠保持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮細胞保護作用［1，4，5］。本研究證實:小鼠 PD 模型行為學(xué)變化與TH、CB神經(jīng)元前后形態(tài)學(xué)改變、表達含量的變化密切相關(guān)，具有一致性［6］。LiCl能改善MPTP所致小鼠PD模型的行為學(xué)障礙;LiCl對DA神經(jīng)元保護作用，表現(xiàn)為促進TH與CB表達，促進軸突生長、細胞分化，維持多巴胺能神經(jīng)元的存活［7］;抑制MPTP的神經(jīng)毒性;提高神經(jīng)元的抗損傷能力，改善神經(jīng)元的可塑性與自我保護功能;促進殘存的DA能神經(jīng)元合成及釋放能力;增加DA神經(jīng)遞質(zhì)含量、更新率、TH活性，增加DA受體敏感性和受體數(shù)目;促進星形膠質(zhì)細胞的增生，抑制小膠質(zhì)細胞的激活;阻斷脂質(zhì)過氧化與超氧陰離子自由基的產(chǎn)生;促進BDNF的分泌，通過 BDNF-TrkB 途徑保護 DA 神經(jīng)元［8，9］;增加 Bcl-2/Bax的表達［10］;激活蛋白激酶C(PKC)、腺苷酸環(huán)化酶(AC)、G-蛋白(Gs-蛋白)、MAPK/ERK激酶及在激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的同時通過其間的“cross talk”激活NF-kB兩條通路發(fā)揮多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶位協(xié)同作用，防止DA能神經(jīng)元的變性凋亡，發(fā)揮保護作用［11～13］。

［1］袁紅花，袁鳳剛，高殿帥，等.鈣結(jié)合蛋白-D28K對腦內(nèi)DA能神經(jīng)細胞的保護作用［J］.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011，49(3):22 －26.

［2］肖成華，王炎強，劉洪梅，等.氯化鋰對PD小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元保護作用的實驗研究［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2006，23(6):652－654.

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