水彩紅 曹 紅 陳玉敏 胡 丹

（中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所，北京 100071）

河車補丸為國家藥典委員會“提高國家藥品標(biāo)準(zhǔn)行動計劃”品種，該品種原收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中藥成方制劑）第3冊，是由紫河車、人參、續(xù)斷等十二味中藥組成的復(fù)方制劑。具有滋腎陰，補元氣之功效，臨床上用于腎陰不足，元氣虧損引起；身體消瘦，精神疲倦，腰酸腿軟，自汗盜汗的治療[1]。其原標(biāo)準(zhǔn)中沒有含量測定項，為有效地控制其質(zhì)量，確保療效，本文建立了河車補丸中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的液相色譜含量測定方法。該方法簡便快速，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能較好的控制其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1100高效液相色譜儀，Agilent化學(xué)工作站（美國）。KQ-300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

1.2 試藥

河車補丸（由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠提供，批號為：60139000、60139001、60139002），規(guī)格：每丸重9g；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（111685-200401 供含量測定用）、購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜純），水（雙重蒸餾水），其他試劑均為分析純。

2 實驗方法與結(jié)果[2-4]

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent Extend-C18（250mm×4.6mm；5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（27∶73）；檢測波長為212nm；進樣量：10μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含200μg 的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取重量差異項下的本品，剪碎，混勻，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，加熱回流60min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性空白對照溶液的制備

按處方比例制備缺續(xù)斷藥材的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法，制備陰性空白對照溶液。

表1 樣品加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.5 專屬性試驗

取陰性空白對照溶液，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果空白對照溶液在與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品相同保留時間處，未顯示明顯色譜峰，認(rèn)為無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.6 線性關(guān)系的考察

精密吸取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液（0.938mg/mL ）0.4、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、10.0mL，至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成不同濃度的對照品溶液，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），川續(xù)斷皂苷Ⅵ進樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=179.76X-1.9298 相關(guān)系數(shù)r=0.9999（n=7）。結(jié)果表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ在0.04256mg～2.1280mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取重復(fù)性試驗中的一份供試品溶液，在0、3、5、10、20、24h分別進樣10μL，記錄峰面積。結(jié)果6次進樣川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積的RSD為0.97%，表明供試品溶液在24h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批次河車補丸（6013900）樣品2g，精密稱定，平行6份，按供試品測定法測定，測得川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均含量為2.188mg/g，RSD為0.52%（n=6）。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的河車補丸（6013900）樣品約1g，精密稱定，平行6份，按100%比例精確加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（2.27mg/mL）1mL，按“供試品溶液的制備”項下操作，計算回收率，測得川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均回收率為100.61%，RSD為0.97%，結(jié)果見表1。

2.10 樣品測定

精密吸取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液、供試品溶液各10μL，按上述色譜條件測定，以外標(biāo)法計算樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，共測定3批樣品，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果（n=2）

3 討 論[5,6]

3.1 流動相的選擇

分別采用甲醇-水（35∶65），乙腈-0.1%磷酸溶液（27∶73），乙腈-0.1%磷酸溶液（30∶70）等系統(tǒng)為流動相。結(jié)果表明以乙腈-0.1%磷酸溶液（27∶73）為流動相，樣品中其他色譜峰與川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰分離效果好。

3.2 檢測波長的選擇

在實驗中，對川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液在200～400nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ在212nm處呈最大吸收值，靈敏度最高，故選擇其為測定波長。

3.3 色譜柱的選擇

選用了三種色譜柱進行比較：Agilent Extend-C18（250mm×4.6mm；5μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）、Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm），結(jié)果本法最終選擇了Agilent Extend-C18（250mm×4.6mm；5μm）色譜柱作為方法學(xué)的考察用色譜柱，可使川續(xù)斷皂苷Ⅵ達到基線分離。

3.4 含量測定項下供試品溶液提取溶媒的選擇

分別采用了甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇作為提取溶媒進行比較，結(jié)果顯示甲醇提取較完全，選擇甲醇作為測定續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取溶劑。

3.5 供試品溶液提取方法的選擇

分別采用超聲處理20min、30min、60min，加熱回流30min、60min、90min，進行測定。以加熱回流60min川續(xù)斷皂苷Ⅵ基本提取完全，選擇加熱回流60min的提取方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:309.

[2]陳海飛,孫艷.HPLC法測定愈骨療傷膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2010,27(1):57-58.

[3]馬新飛.HPLC法測定不同續(xù)斷炮制品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ[J].中草藥,2007,38(5):707-708.

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