楊志超 張麗莉 盧翠華* 邸 宏 姜麗麗 張正國 林忠平胡鳶雷

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是茄科茄屬雙子葉植物，是世界四大糧食作物之一，由于它具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營養(yǎng)成分全和加工產(chǎn)業(yè)鏈長等特點(diǎn)，受到了全世界的廣泛重視。我國是世界馬鈴薯生產(chǎn)第一大國，面積和總產(chǎn)量占全世界的1/4（盧翠華 等，2009）。

蟲害是造成馬鈴薯減產(chǎn)的主要原因，其中金龜子科害蟲金龜子（幼蟲俗稱蠐螬）是世界范圍內(nèi)廣泛分布的地下害蟲之一。金龜子成蟲、幼蟲均可危害馬鈴薯，但幼蟲危害較大。傳統(tǒng)化學(xué)藥劑防治不僅危害人類健康，而且造成環(huán)境污染（姚慶學(xué) 等，2003）。自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化以來，全球種植的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物面積已經(jīng)達(dá)到2 625萬hm2（James，2008）。其中對金龜子科害蟲具有殺蟲作用的蘇云金芽胞桿菌cry類基因的相繼發(fā)現(xiàn)和克隆，為害蟲的防治提供了新的途徑。Yu等（2006）從Bt185中克隆了P2300-pa-8ea1基因。

本試驗(yàn)將來源于Bt菌株Bt185的P2300-pa-8e基因?qū)腭R鈴薯中，期望獲得抗蟲的馬鈴薯材料，為馬鈴薯抗性育種提供新資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和菌株

試驗(yàn)于2009年7月～2010年5月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

供試馬鈴薯品種為早大白和克新18號（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供）。

供試農(nóng)桿菌菌種為LBA4404（北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供），植物表達(dá)載體質(zhì)粒P2300-Pa-8e（圖1），利用Patatin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)P2300-pa-8e（500 bp）基因的表達(dá)，質(zhì)粒由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林中平教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工程菌液的制備 挑取含有質(zhì)粒P2300-Pa-8e的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種于含有卡那霉素（Kan）、鏈霉素（Str）和利福平（Rif）的YEB培養(yǎng)基中，避光震蕩培養(yǎng)。從中取500 μL菌液接種于50 mL相同的YEB培養(yǎng)基中，以相同條件震蕩培養(yǎng)。到對數(shù)生長期，在4 000 r·min-1條件下離心5 min，棄上清液，重懸于MS液體培養(yǎng)基中，為工程菌液。

1.2.2 薯塊再生培養(yǎng)基的篩選 將馬鈴薯早大白和克新18號脫毒微型薯滅菌、去皮，切成薄片，放入工程菌液中進(jìn)行定時(shí)侵染，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng) 2～3 d。分別接種于9種再生培養(yǎng)基上（表1），誘導(dǎo)薯塊出芽。待芽長到2～3 cm時(shí)剪下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根（叢培琳 等，2008；姜麗麗 等，2009）。

1.2.3 共培養(yǎng)時(shí)間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響 在菌液OD600值為0.5、浸染時(shí)間為5 min的條件下，用農(nóng)桿菌感染薯片，置于 28 ℃黑暗條件下分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，統(tǒng)計(jì)抗性愈傷的誘導(dǎo)率。

1.2.4 PCR檢測 使用索來寶公司的植物總DNA提取試劑盒提取馬鈴薯植株的總DNA，以轉(zhuǎn)化植株的總DNA為模板，未轉(zhuǎn)化植株的總DNA作陰性對照，以P2300-pa-8e質(zhì)粒為陽性對照，根據(jù)P2300-pa-8e基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物（PrimerⅠ：5′-GGCGGCAGCATTCAAACTCAA-3′，PrimerⅡ：5′-ATCTCCACCAAGATAGTGTCC-3′），對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系（25 μL）：超純水16.5 μL，25 mg·mL-1MgCl21.5μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 μmol·L-1PrimerⅠ 0.5 μL，10 μmol·L-1primerⅡ 0.5μL，50 ng·μL-1模板1.0 μL，5 U·μLTaq酶0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min；4 ℃終止反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

圖1 P2300-Pa-8e植物表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

表1 不同薯塊再生培養(yǎng)基的激素配比

1.2.5 Southern-blot雜交檢測 用SacⅠ酶切轉(zhuǎn)基因植株DNA，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)變性、中和，用高鹽轉(zhuǎn)移法（薩姆布魯克，2002）將膠上的樣品轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以目的基因P2300-pa-8e為探針，采用地高辛試劑盒進(jìn)行雜交、洗膜、顯影。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的移栽 將通過Southern-blot雜交檢測的轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)15～20 d，煉苗后移入小盆中，放入溫室培養(yǎng)，7 d左右轉(zhuǎn)入網(wǎng)室培養(yǎng)。

1.2.7 抗蟲試驗(yàn) 用轉(zhuǎn)基因小薯與對照小薯分別喂養(yǎng)暗黑鰓金龜幼蟲（3～4日齡）、華北大黑鰓金龜幼蟲（3～4日齡）、黃粉蟲幼蟲和超級大麥蟲幼蟲。暗黑鰓金龜（3～4日齡）、華北大黑鰓金龜（3～4日齡）的幼蟲采用室內(nèi)殺蟲活性測定（王容燕 等，2007），黃粉蟲、超級大麥蟲的幼蟲采用飼料混合法（張杰 等，2002）進(jìn)行生物測定。每處理 24頭初孵幼蟲，3次重復(fù)，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于48、72、96 h記錄死蟲數(shù)，并計(jì)算校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 共培養(yǎng)時(shí)間的確定

共培養(yǎng)時(shí)間的長短對遺傳轉(zhuǎn)化效率有影響，而且不同物種及外植體材料與農(nóng)桿菌的最佳共培養(yǎng)時(shí)間也不同。從圖2可以看出，早大白和克新18號薯片的共培養(yǎng)時(shí)間均在第3天時(shí)抗性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，分別為92.16%和97.77%。

圖2 共培養(yǎng)時(shí)間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

2.2 薯塊再生培養(yǎng)基的確定

以MS為基本培養(yǎng)基，以早大白為試材，研究添加IAA和ZT兩種激素對誘導(dǎo)馬鈴薯再生率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），使用M8培養(yǎng)基時(shí)，獲得的出芽率最高，高達(dá) 93.55%；而使用M1培養(yǎng)基培養(yǎng)的薯塊出芽率最低，僅有33.33%。因此，本試驗(yàn)條件下最優(yōu)薯塊再生培養(yǎng)基為M8（MS+4.0 mg·L-1ZT +1.0 mg·L-1IAA）。

表2 不同激素濃度配比對早大白薯塊生長的影響

2.3 轉(zhuǎn)基因植株與薯塊的獲得

馬鈴薯薯塊經(jīng)培養(yǎng)20～30 d后分化出芽。早大白接種薯塊 36塊，誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株 42株，有19株通過生根階段篩選，抗性植株再生頻率為52.78%；克新18號接種薯塊32塊，誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株54株，有21株通過生根階段篩選，抗性植株再生頻率為65.63%。將抗性植株移入網(wǎng)室，9月收獲薯塊（圖3）。

圖3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)克新18號薯塊遺傳轉(zhuǎn)化再生植株與小薯的獲得

2.4 PCR檢測

對早大白和克新 18號所獲得的抗性植株進(jìn)行PCR鑒定，得到了約500 bp的特異性條帶（圖4），與陽性對照質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果一致，陰性對照沒有特異性擴(kuò)增條帶。PCR檢測結(jié)果初步表明，P2300-pa-8e基因已整合到受體基因組中。

圖4 抗性植株P(guān)CR檢測

2.5 Southern-blot雜交檢測

將PCR檢測呈陽性的植株進(jìn)行Southern-blot雜交，使用SacⅠ對轉(zhuǎn)基因植株DNA進(jìn)行酶切，在5株早大白、10株克新18號PCR陽性植株中，4株早大白、6株克新18號有雜交信號（圖5），其中4株為雙拷貝，6株為單拷貝。不同植株外源基因插入位點(diǎn)不同，說明不同植株之間是相對獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植株。

圖5 轉(zhuǎn)化植株Southern-blot雜交檢測

2.6 抗蟲試驗(yàn)

以非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯為對照，測定P2300-pa-8e基因表達(dá)產(chǎn)物對暗黑鰓金龜、華北大黑鰓金龜、黃粉蟲、超級大麥蟲幼蟲的毒力。結(jié)果表明，對暗黑鰓金龜、華北大黑鰓金龜齡幼蟲7 d的校正死亡率分別為26.38%、34.72%；14 d的校正死亡率分別為47.22%、55.56%；而對黃粉蟲、超級大麥蟲幼蟲均未表現(xiàn)活性。

3 結(jié)論與討論

選擇馬鈴薯微型薯作為外植體，遺傳轉(zhuǎn)化過程中具有再生速度快、出芽率高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)。

培養(yǎng)基中激素的組成和濃度是影響植株再生的關(guān)鍵，生長素和分裂素比例合適可以提高胚狀體發(fā)生頻率。從諸多馬鈴薯再生培養(yǎng)的報(bào)道中可以看出，所使用的外源激素大相徑庭（張寧等，2004），用一種或幾種培養(yǎng)基并不適合所有的品種。因此，需針對不同基因型選擇誘導(dǎo)再生的激素種類和濃度。本試驗(yàn)使用MS+4.0 mg·L-1ZT+1.0 mg·L-1IAA為薯塊再生培養(yǎng)基時(shí)獲得的出芽率最高，高達(dá)93.55%。

適當(dāng)?shù)墓才囵B(yǎng)時(shí)間能提高轉(zhuǎn)化效率，本試驗(yàn)結(jié)果表明，共培養(yǎng)時(shí)間以外植體周圍剛出現(xiàn)白色菌落時(shí)為最佳（一般共培養(yǎng)2～3 d），早大白和克新18號最佳共培養(yǎng)時(shí)間均為3 d。這樣既可提高轉(zhuǎn)化頻率，又易于去除農(nóng)桿菌。達(dá)到最佳生長狀態(tài)的共培養(yǎng)時(shí)間則由農(nóng)桿菌菌液的生長狀態(tài)、菌液濃度、外植體類型及培養(yǎng)條件等決定。

對誘導(dǎo)生根的40株馬鈴薯抗性植株進(jìn)行PCR檢測，有14株呈PCR陽性反應(yīng)，但都出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增條帶，其原因可能是：① 引物與靶序列不完全互補(bǔ)或引物聚合形成二聚體。② Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多。③ 酶的質(zhì)和量，有些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶，而另一來源的酶則不出現(xiàn)；酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

經(jīng)Southern-blot檢測，有10株為轉(zhuǎn)基因植株，表明在本試驗(yàn)中存在假轉(zhuǎn)化體。分析原因可能有：① 外植體的表層細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)外源選擇抗性基因，為其他一些非轉(zhuǎn)化細(xì)胞提供了一道屏障，逃避了選擇壓力的影響而繼續(xù)分裂和分化。② T-DNA進(jìn)入細(xì)胞后并沒有整合到受體基因組中，而是以游離狀態(tài)存在，導(dǎo)致PCR呈陽性反應(yīng)。因此只有進(jìn)行植物基因組的Southern-blot分析，才可以準(zhǔn)確地了解外源基因在轉(zhuǎn)化植株基因組中的整合情況。

本試驗(yàn)通過對薯塊的抗蟲試驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對鱗翅目害蟲黃粉蟲、超級大麥蟲無活性，對鞘翅目害蟲暗黑鰓金龜和華北大黑鰓金龜表現(xiàn)出抗性，為馬鈴薯抗性品種的培育提供了新的材料和方法。

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