閆翠環(huán)，方敬，陳志強(qiáng)，王艷素，陳金金，劉云肖，姜秀娟（.河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊市05009；2.河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院，石家莊市 0500；.河北省人民醫(yī)院，石家莊市 05005）

馬杉氏腎炎（Masugiglomerulonephritis，MGN）是一種典型的抗腎小球基底膜性腎小球腎炎，其主要臨床表現(xiàn)為腎病綜合征（NS），隨著疾病的發(fā)展甚至?xí)鹉I功能的嚴(yán)重?fù)p傷[1]。前期研究證實(shí)[2]，腎舒康合劑能使陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）致膜性腎小球腎炎動物的尿蛋白明顯減少，降低血清肌酐和血尿素氮的含量，改善腎組織的病理狀態(tài)。筆者通過給白兔注射羊抗兔腎血清復(fù)制MGN模型，同時(shí)用腎舒康合劑進(jìn)行干預(yù)性治療，以探討腎舒康合劑對MGN的治療作用及其可能的機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HM IAS-2000型醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司）；H7500型透射電鏡（日本Hitachi公司）；LSM 510META型熒光顯微鏡、HM 340E型石蠟切片機(jī)（德國Zeiss公司）；UCT型超薄切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2 試藥

腎舒康合劑（由黃芪、黃精、白花蛇舌草、地龍、川芎、積雪草、柴胡、丹參、生地黃、石葦組成，藥材均購自河北省安國市一方中藥材有限公司，由河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院中藥房孟熙中藥師鑒定為真品）由河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院提供（批號：20100209）；雷公藤多苷（湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號：20050702）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，批號：Lot102K8930）。

1.3 動物

清潔級成年綿羊1只，♀，體重25 kg，由解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007-0003）；健康新西蘭種大耳白兔40只，♀♂兼半，體重1.75～2.25 kg，由武漢市新州區(qū)全耀動物養(yǎng)殖場提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2004-0006）。

2 方法

2.1 復(fù)制模型與分組

按文獻(xiàn)方法[3]制備羊抗兔腎血清，將所有白兔隨機(jī)分為正常、模型、腎舒康合劑、雷公藤多苷組。除正常組外，其余各組白兔均經(jīng)耳緣iv羊抗兔腎血清，每次2m L，間隔0.5 h注射1次，共6次。檢測尿蛋白呈陽性反應(yīng)，表明MGN模型復(fù)制成功[4]。

2.2 給藥

文獻(xiàn)報(bào)道[2]，腎舒康合劑對MGN模型白兔腎炎的治療中，中劑量組與雷公藤多苷組療效差異無顯著性，3倍遞增的高劑量組作用優(yōu)于雷公藤多苷組，故筆者選擇相當(dāng)于中劑量組的生藥劑量重點(diǎn)觀測。各組用藥量分別為：腎舒康組8.16 g·kg-1，雷公藤多苷組5mg·kg-1，模型和正常組給予等容量生理鹽水，于復(fù)制模型成功后第1天開始ig給藥，每天1次，連續(xù)4周。

2.3 標(biāo)本采集與檢測

2.3.1 光鏡觀察 于用藥4周后殺檢白兔，取部分腎組織，4%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，以3μm的石蠟切片，行HE、PASM染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍片。置普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎小球及腎小管間質(zhì)病變情況。每份標(biāo)本于低倍鏡下觀察20個(gè)不同的腎小管間質(zhì)視野，按腎小球纖維素沉積數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)進(jìn)行半定量評分，評估腎小管間質(zhì)損傷程度。

2.3.2 電鏡觀察 取右腎上極皮質(zhì)1mm3，經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸磷酸鈉緩沖液雙固定，丙酮梯度脫水，815環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并拍片。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 腎組織病理形態(tài)半定量圖像分析結(jié)果

腎舒康合劑組和雷公藤多苷組與模型組比較，纖維素沉積數(shù)顯著下降（P＜0.01），腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)顯著下降（P＜0.05）。腎小球纖維素沉積數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較結(jié)果見表1（空白組略去）。

表1 腎小球纖維素沉積數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Com parison of the cellulose deposition number and tubular injury inde（x±s，n＝10）

表1 腎小球纖維素沉積數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Com parison of the cellulose deposition number and tubular injury inde（x±s，n＝10）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.modelgroup：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型組腎舒康合劑組雷公藤多苷組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)3.16±0.75 2.31±0.67＊2.28.±0.36＊n 81 0 10纖維素沉積數(shù)/%80.84±11.36 61.46±20.31＊＊61.24±19.73＊＊

3.2 光鏡觀察結(jié)果

3.2.1 HE染色 與正常組比較，模型組基底膜彌散性增厚，系膜基質(zhì)增多，膠原纖維增生，可見局灶節(jié)段性腎小球硬化，腎小球囊壁層細(xì)胞增生，有新月體形成；腎小管上皮細(xì)胞顆粒樣變性、腫脹，管腔狹窄，部分小管腔內(nèi)可見蛋白、管型；間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，腎舒康合劑組膠原纖維增生不明顯，未出現(xiàn)腎小球硬化，未見新月體形成，腎小管間質(zhì)病變明顯減輕；雷公藤多苷組的病理改變與腎舒康組相似，但腎小管間質(zhì)病變程度較腎舒康合劑組的略輕。病理切片（HE染色）見圖1。

圖1 病理切片（HE，400×）A.正常組；B.模型組；C.腎舒康合劑組；D.雷公藤多苷組Fig 1 Pathologicalslice（HE，400×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang mixture group；D.triptergium glycosidesgroup

3.2.2 PASM染色 正常組基底膜正常，呈黑色，系膜基質(zhì)呈黑細(xì)絲狀，腎小管間質(zhì)無異常。模型組可見基底膜重度彌散性增厚，可見局灶節(jié)段性腎小球硬化，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞變性，管腔擴(kuò)張充血，間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤，可見散在的纖維增生。與模型組比較，腎舒康合劑組未出現(xiàn)腎小球硬化，腎小球囊內(nèi)壁光滑，未見新月體形成，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹；雷公藤多苷組的病理改變與腎舒康合劑組相似。病理切片（PASM染色）見圖2。

圖2 病理切片（PASM，400×）A.正常組；B.模型組；C.腎舒康合劑組；D.雷公藤多苷組Fig 2 Pathologicalslice（PASM，400×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang m ixture group；D.triptergium glycosidesgroup

3.3 電鏡觀察結(jié)果

正常組腎小球上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜結(jié)構(gòu)均正常，上皮細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)清晰，呈杵樣并列排列于基底膜外側(cè)；內(nèi)皮細(xì)胞窗孔排列整齊；基底膜結(jié)構(gòu)均勻完整。模型組腎小球基底膜呈節(jié)段性不規(guī)則增厚；上皮細(xì)胞足突腫脹，排列紊亂，出現(xiàn)節(jié)段性輕、中度融合，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重腫脹。腎舒康合劑組與雷公藤多苷組腎小球基底膜增厚不明顯，或僅呈輕度增厚，腎小球上皮細(xì)胞足突有部分融合；內(nèi)皮細(xì)胞窗孔排列基本整齊；毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無明顯腫脹。病理切片（透射電鏡）見圖3。

圖3 病理切片（透射電鏡，20 000×）A.正常組；B.模型組；C.腎舒康合劑組；D.雷公藤多苷組Fig 3 Pathologicalslice（TEM，20 000×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang m ixture group；D.triptergium glycosidesgroup

4 討論

MGN模型是于1900年由LindemanW首次介紹[5]，其后由Masugi加以發(fā)展和特征化，故名Masugi腎炎。它是異種抗體直接與腎小球基底膜上的抗原相結(jié)合形成的一種腎炎模型，是一種典型的抗腎小球基底膜的腎小球腎炎。慢性腎臟疾病最終導(dǎo)致終末期腎衰的發(fā)生，其特征是腎功能的逐漸丟失、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的持續(xù)堆積，從而導(dǎo)致間質(zhì)纖維化。多種腎臟疾病腎功能的惡化很大程度上取決于間質(zhì)損害的嚴(yán)重性[6]。

腎舒康合劑由黃芪、黃精、生地黃、丹參、川芎、石葦、白花蛇舌草、積雪草、柴胡、地龍10味中藥組成，共奏健脾補(bǔ)腎、活血化瘀、清熱利濕之功效。黃芪含有黃芪多糖、黃芪皂苷類、黃酮和黃酮類似物等成分，有清除自由基、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、誘生干擾素等作用；黃芪還富含微量元素硒，對腎小球基底膜的電荷屏障和機(jī)械屏障均有保護(hù)作用，從而減輕通透性蛋白尿，對腎性蛋白尿有減輕和消除作用，改善腎小管損傷和間質(zhì)纖維化病變，保護(hù)腎組織[7，8]；與黃精、生地黃配伍還能提高機(jī)體的非特異性免疫力，發(fā)揮對腎組織的保護(hù)作用。丹參是治療腎纖維化的常用中藥之一，其分離出的有效成分丹參酮ⅡA磺酸鈉可通過對腎組織結(jié)締組織生長因子（CTGF）的抑制而發(fā)揮防治腎間質(zhì)纖維化的作用[9]。川芎嗪能改善動物的高凝狀態(tài)，減輕腎小球ECM過度凝集狀態(tài)和腎間質(zhì)單核巨噬細(xì)胞浸潤所引起的炎癥過程，減少尿蛋白，延緩腎功能損害[10]。丹參、川芎與地龍合用可起到改善高凝狀態(tài)，清除自由基，抑制和排除免疫復(fù)合物的作用。白花蛇舌草有清熱除濕、活血止痛等功效，其含有的總黃酮具有增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫功能和非特異性免疫功能的作用，亦可以刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)增生，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞活力而達(dá)到抗菌消炎作用[11]。積雪草可以通過直接抑制生長轉(zhuǎn)化因子（TGF-β1）的表達(dá)并間接維持重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抗腎間質(zhì)纖維化的作用[12]。

本研究結(jié)果表明，腎舒康合劑能明顯抑制ECM和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，減輕腎小管管腔狹窄的變化，通過保護(hù)腎小球?yàn)V過膜，修復(fù)損傷的腎小球上皮細(xì)胞發(fā)揮減輕病理損害、防止腎臟受到進(jìn)一步損傷的作用。

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