張鵬，孟碩，李欣志，劉建勛（中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院實驗研究中心，北京市100091）

中藥梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides的干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，在中醫(yī)臨床中主要用于治療高血壓、高熱黃疸、小便短赤等證。梔子果實中主要含有黃酮類、環(huán)烯醚萜類、環(huán)烯醚酮類、有機酸酯類等化合物，其中環(huán)烯醚萜類成分為國內(nèi)、外公認的中藥梔子的主要有效成分[1]。近年研究表明，梔子環(huán)烯醚萜類成分中梔子苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠的腦組織有明顯的保護作用[2]，并且梔子苷在腦缺血狀態(tài)下的血藥濃度和吸收效果優(yōu)于正常狀態(tài)，在體內(nèi)停留的時間較長，消除較慢[3]。此外，梔子苷能以較高的透過率通過體外模擬的血腦屏障[4]，但梔子環(huán)烯醚萜類中不同成分是否能夠在體通過血腦屏障還需要進一步的研究。因此，本研究采用犬iv梔子環(huán)烯醚萜類成分的給藥方式，通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)對腦脊液的檢測，分析梔子環(huán)烯醚萜類中透過血腦屏障的成分或代謝物，為中藥梔子治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并有助于將來梔子治療腦缺血機制研究的深入開展。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜（HPLC）儀、chemstation工作站（美國Agilent公司）；BV Pulsera型X光機（荷蘭Philips公司）；API4000Q-TRAP型三重四極桿串聯(lián)MS儀（美國Applied Biosystem公司）；Bruker DRX-500NMR型核磁共振（NMR）儀（德國Bruker公司）；圖譜由北京微量化學研究所分析中心代測。

1.2 試藥

梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：11079-200410）；梔子苷酸標準品（日本和光純藥工業(yè)株式會社，批號：CDR4496）；梔子藥材，購自河北省安國市神農(nóng)中藥飲片有限公司，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院圖雅教授鑒定為真品；戊巴比妥鈉、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

健康犬3只，2♂1♀，體重（16.5±1.7）kg，由北京海淀區(qū)學院路通利實驗動物養(yǎng)殖廠提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2010-004）。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子環(huán)烯醚萜的制備

梔子藥材加水煎煮提取，通過中等極性大孔吸附樹脂柱，反復精制，得到梔子環(huán)烯醚萜類成分，相當于含生藥20mg·m L-1。

2.2 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（15∶85）；流速：1.0m L·m in-1；檢測波長：238 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

2.3 腦脊液樣品的預處理

采集犬腦脊液約300 μL，10 000 r·m in-1離心15m in，取上清液分裝凍存，取10μL上清液進樣分析。

2.4 供試品溶液的制備

取“2.3”項下處理的犬腦脊液100μL作為供試品溶液。

2.5 對照品溶液的制備

精密稱取梔子苷對照品10 mg，置于25 m L量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，精密量取2m L，置于10m L量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，制成每1m L含80μg的溶液，備用。

2.6 動物實驗

健康犬（實驗前12 h禁食不禁水），稱重，于前臂橈iv 3%的戊巴比妥鈉30mg·kg-1麻醉，背臥固定于手術(shù)臺上。清理頭頂皮膚并75%乙醇消毒，在X光機引導下插入穿刺針至延髓池并固定，穿刺針尾部連接1m L注射器，用于采集腦脊液。同時分離股靜脈，結(jié)扎遠心端并插入靜脈插管，用線結(jié)扎牢固，建立靜脈給藥通路。犬腦脊液穿刺X光片見圖1。

圖1 犬腦脊液穿刺X光片F(xiàn)ig 1 X-ray of cerebrospinal fluid obtained in dogs

2.7 給藥和樣品采集

每只犬從股靜脈通路快速推注梔子環(huán)烯醚萜，注射劑量均為10m L·kg-1。注射完畢時間計為零，開始記錄用藥后取腦脊液時間，每間隔30min采集腦脊液100μL，持續(xù)90min，將3個時間段內(nèi)收集到的腦脊液混合，按“2.3”項下方法離心取上清液后分裝凍存，備用。每只犬在給藥前采集200μL腦脊液作為空白對照。

2.8 色譜測定方法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入色譜儀進行測定。

2.9 犬腦脊液中梔子環(huán)烯醚萜類成分的分析

通過對照品對照分析認為，在腦脊液中的化學成分有梔子苷的原形，沒有梔子苷的代謝產(chǎn)物京尼平和梔子苷酸。檢測到的梔子環(huán)烯醚萜中除梔子苷（c）外，另有2個色譜峰b、a。通過反復體外層析分離，再經(jīng)LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)，色譜b碎片離子峰與體內(nèi)檢測峰相一致，分子量為550。1H-NMR（D2O）δ：3.74（3H，s，COOCH3）、4.47（1H，d，J＝8Hz）、4.83（1H，d，J＝8 Hz）、5.26（1H，d，J＝7 Hz，H-1）、5.87（1H ，s，H-7）、7.55（1H，s，H-3）；13C-NMR（D2O，DSS為內(nèi)標）δ：99.9（C-1）、155.2（C-3）、114.3（C-4）、37.0（C-5）、40.7（C-6）、132.7（C-7）、144.1（C-8）、48.4（C-9）、57.1（C-10）、173.0（C-11）、54.5（OMe）、101.4（C-1′）、75.4（C-2′）、78.6（C-3′）、72.4（C-4′）、78.4（C-5′）、71.3（C-6′）、105.8（C-1″）、75.8（C-2″）、78.4（C-3″）、72.3（C-4″）、78.3（C-5″）、63.5（C-6″），以上數(shù)據(jù)與文獻[2]報道一致，鑒定為京尼平-β-D-龍膽雙糖苷（Genipin-1-β-D-gentiobioside）。

同樣，色譜 a LC-MS[M+Na]+m/z：427，分子量為 404。1H-NMR（D2O）δ：4.96（1H，d，J＝9 Hz，H-1）、7.69（1H，d，J＝1 Hz，H-3）、3.11（1H，m，H-5）、6.02（1H，d，J＝2 Hz，H-7）、2.65（1H，t，H-9）、3.74（3H，s，COOCH3）；13C-NMR（D2O）δ ∶100.4（C-1）、154.8（C-3）、106.5（C-4）、69.6（C-l1）、40.1（C-5）、3.8（C-6）、128.5（C-7）、148.9（C-8）、44.1（C-9）、59.8（C-10）、51.6（OMe）、98.7（C-1′）、73.8（C-2′）、72.5（C-3′）、69.2（C-4′）、75.9（C-5′）、60.3（C-6′），以上數(shù)據(jù)與文獻[5]數(shù)據(jù)一致，鑒定為去乙酰基車葉草苷酸甲酯（Deacetyl-asperulosidic acidmethyl ester）。色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.空白腦脊液；B.含環(huán)烯醚萜類成分腦脊液；a.去乙?；嚾~草苷酸甲酯；b.京尼平-β-D-龍膽雙糖苷；c.梔子苷Fig 2 HPLC chromatograms A.blank cerebrospinal fluid；B.cerebrospinal fluid containing iridoid compounds；a.deacetyl-asperulosidic acidmethyl ester；b.Genipin-1-β-D-gentiobioside；c.geniposide

3 討論

血腦屏障是腦屏障最重要的組成部分，維持著中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的穩(wěn)定，但同時也限制了多數(shù)藥物進入腦組織對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療作用。因此，通過血腦屏障是藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的前提條件。反之，將腦脊液中的化學組分進行生物活性的篩選，也是新藥發(fā)現(xiàn)的重要途徑。本研究對犬采用iv的方式給予梔子環(huán)烯醚萜類成分，在給藥90 m in后腦脊液的檢測中發(fā)現(xiàn)梔子環(huán)烯醚萜類成分中京尼平-β-D-龍膽雙糖苷、去乙?；嚾~草苷酸甲酯和梔子苷的存在。提示這3種化合物可能是梔子發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療作用的主要活性成分。在目前神經(jīng)藥理研究中，梔子苷可通過提高缺氧缺糖再灌注損傷神經(jīng)細胞線粒體的活性[6]，減輕腦血管內(nèi)皮細胞損傷，抑制腦缺血后炎癥因子和黏附分子的表達[7]，以及對抗自由基[8]和Ca2+超載[9，10]引起神經(jīng)元損傷等途徑干預腦缺血損傷級聯(lián)放大反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)，達到保護缺血腦組織的目的。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者認為梔子苷透過血腦屏障是以上藥理活性的直接原因和首要條件；京尼平-β-D-龍膽雙糖苷和去乙酰基車葉草苷酸甲酯可能也具有一定的中樞神經(jīng)藥理活性，但這些設(shè)想還需要進一步分析驗證。

在正常生理狀態(tài)下，血腦屏障是由排列緊密的上皮細胞組成，物質(zhì)交換方式為水溶性小分子直接經(jīng)細胞間隙擴散，脂溶性分子經(jīng)跨膜擴散，特異受體介導的胞飲作用，特異載體通道等。雖然本研究結(jié)果證實，京尼平-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰基車葉草苷酸甲酯和梔子苷能夠通過血腦屏障，但是透過的機制還需要進一步的深入研究。

[1]張留記，劉欽松，屠萬倩，等.RP-HPLC法同時測定不同產(chǎn)地梔子中梔子苷、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量

[J].中國藥房，2011，22（7）：630.

[2]Masateru Ono，Masm i Ueno，Chikako Masuoka，et al.Iridoid glucosides from the fruitof genipa americana[J].Chem Phar Bull，2005，53（10）：1 342.

[3]張占軍，汪麗婭，王 忠，等.黃芩苷、梔子苷及其配伍治療局灶腦缺血大鼠藥效評價及作用機制研究[J].中國中藥雜志，2006，31（11）：907.

[4]曾明飛，潘林梅，朱華旭，等.黃連解毒湯中梔子苷在正常及腦缺血大鼠體內(nèi)藥動學研究[J].中草藥，2010，41（4）：617.

[5]Boros CA，Sterm itz FR.Iridoids，an updated review[J].J NatProd，1990，53（5）：1 055.

[6]李偉華，朱陵群，王碩仁，等.黃芩苷、梔子苷對神經(jīng)細胞缺氧缺糖/再灌注損傷的保護作用[J].中國藥學雜志，2004，39（5）：344.

[7]徐麗榮，馬世彬，李澎濤，等.清開靈有效組分對MCAO大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的影響[J].中藥材，2004，27（5）：348.

[8]朱曉磊，張 娜，李澎濤，等.梔子苷阻抑腦缺血損傷級聯(lián)反應(yīng)的作用環(huán)節(jié)探討[J].中國中藥雜志，2004，29（11）：1 065.

[9]李傳云，李澎濤，潘彥舒，等.牛黃、梔子配伍對大鼠局灶性腦缺血再灌注不同時段脂質(zhì)過氧化損傷的影響[J].中國醫(yī)藥學報，2004，19（9）：528.

[10]YamazakiM，Chiba K，Yoshikawa C.Genipin suppresses A 23187-induced cytotoxicity in neuron cells[J].Bio Pharm Bull，2009，32（6）：1 043.