唐年忠，吳生齊，楊立偉（.廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，廣州市50080；.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州市 5080）

茵苓祛濕湯為由金銀花、茵陳、茯苓、梔子、布渣葉、木棉花、甘草、神曲等13味藥材組成的臨床驗(yàn)方，功效為祛濕化濁、清熱消滯，臨床主要用于氣滯郁濕所致之濕熱證。綠原酸為方中主藥金銀花與茵陳的指標(biāo)性成分，具有抗病毒、抗菌消炎、清除自由基、降糖、降脂、保肝利膽等多種功效[1]。梔子中含有環(huán)烯醚萜苷類(lèi)有效成分，包括梔子苷、京尼平苷、羥異梔子苷、梔子苷酸等，其中含量最高的是梔子苷和京尼平苷[2]，具有解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、保肝利膽、抗炎殺菌、降壓、防動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓、免疫抑制等作用[3]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定茵苓祛濕湯中綠原酸、梔子苷的含量[4，5]，以為該方劑的新藥開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

HPLC儀，含SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AT四元梯度泵、SPD-20A紫外檢測(cè)器、LC solution化學(xué)工作站（日本島津公司）。

綠原酸、梔子苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110753-200413、0749-200007）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；茵苓祛濕湯（為擬開(kāi)發(fā)成醫(yī)院制劑的臨床煎劑，批號(hào)：090203、090204、090205）；所用藥材均為市售品，均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張軍教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸（13∶87）；流速：1.0 mL·min-1；雙波長(zhǎng)檢測(cè)：綠原酸327 nm、梔子苷238 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：5μL。在上述色譜條件下，綠原酸、梔子苷分離度良好。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸、梔子苷對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含綠原酸0.08 mg、梔子苷0.18 mg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例稱(chēng)取金銀花、茵陳、茯苓、梔子、布渣葉、木棉花、甘草、神曲等13味藥材共63.5 g，加水煎煮2次（10、8倍量），每次1 h。濾過(guò)，合并藥液，測(cè)定體積。精密量取相當(dāng)于1.00 g生藥的提取液，置25 mL棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

另按處方比例，分別同法制備缺金銀花、茵陳陰性對(duì)照溶液與缺梔子陰性對(duì)照溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2、4、8、12、16 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。分別以綠原酸、梔子苷的進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸、梔子苷的回歸方程分別為Y＝2.69×106X+8 521（r＝0.999 7，n＝5）、Y＝1.47×106X－13 294（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，綠原酸、梔子苷的進(jìn)樣量分別在0.154 4～1.235 2、0.363 2～2.905 6 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，綠原酸的平均峰面積積分值為2 076 095，RSD＝1.3%（n＝6）；梔子苷的平均峰面積積分值為2 655 204，RSD＝1.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，綠原酸的平均峰面積積分值為1 490 425，RSD＝1.7%（n＝5）；梔子苷的平均峰面積積分值為764 697，RSD＝1.6%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一茵苓祛濕湯藥液適量，共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，綠原酸的平均含量為2.756 mg·g-1，RSD＝1.9%（n＝6）；梔子苷的平均含量為2.647 mg·g-1，RSD＝1.9%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的茵苓祛濕湯藥液適量，共6份。分別精密量取相當(dāng)于0.50 g生藥量的藥液，精密加入綠原酸、梔子苷對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定樣品含量并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

按處方比例稱(chēng)取茵苓祛濕湯各藥材，共3份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備煎劑及供試品溶液。精密吸取5μL供試品溶液注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定樣品中綠原酸與梔子苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination（n＝3）

3 討論

在上述色譜條件下，金銀花、茵陳雙陰性對(duì)照?qǐng)D譜中，在綠原酸色譜峰處有一小峰干擾。經(jīng)計(jì)算，該干擾峰的峰面積為供試品溶液中綠原酸峰面積的1.8%，＜5.0%，故干擾可忽略。

本試驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定茵苓祛濕湯中有效成分綠原酸、梔子苷的含量，分離效果與重復(fù)性好、簡(jiǎn)便、快捷。該煎劑中有效成分的含量及日服用量可為該制劑及類(lèi)似方劑的新藥研究提供借鑒。

[1] 陳紹華，王亞琴，羅立新.天然產(chǎn)物綠原酸的研究進(jìn)展[J].食品科技，2008，33（2）：195.

[2] 倪慧艷，張朝暉，傅海珍.中藥梔子的研究與開(kāi)發(fā)概述[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（7）：538.

[3] 劉曉棠，趙伯濤，張 玖，等.梔子的綜合開(kāi)發(fā)與利用[J].中國(guó)野生植物資源，2008，27（1）：19.

[4] 孫文武.HPLC法測(cè)定梔柏合劑中梔子苷的含量[J].中國(guó)藥房，2007，18（33）：2 610.

[5] 江 帆，郭培果.HPLC法測(cè)定兒感口服液中綠原酸的含量[J].中國(guó)藥房，2009，20（33）：2 600.