申屠平平,魏霞蓁,王振林,郭劍峰,宋蘭蘭
(1.西安交通大學(xué)天奎醫(yī)藥生物公司,陜西西安 710061;2.浙江省金華市疾病預(yù)防控制中心,浙江金華 321000;3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室,陜西西安 710061)
沙棘脂肪酸組成分制備的更年期的中藥制品,前期研究已證明具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)免疫功能、改善血液流變性和抗組織細(xì)胞衰老等作用,臨床用以治療婦女更年期綜合征。本文為了探索衰老形成的作用機(jī)制,以沙棘脂肪酸配制成為能量調(diào)節(jié)劑,以線粒體為調(diào)控靶標(biāo),觀察老年雌性大鼠線粒體內(nèi)膜蛋白及輔酶成分,呼吸鏈功能、ATP生成等調(diào)節(jié)因素對(duì)衰老形成的影響,以揭示沙棘脂肪酸具有增加線粒體內(nèi)膜蛋白及輔酶活性、調(diào)整改善呼吸鏈功能、促進(jìn)機(jī)體多功能組織、細(xì)胞的新陳代謝等作用[1]。
高通量酶標(biāo)儀 (德國(guó)BMG公司);超高速冷凍離心機(jī) (美國(guó)BECKMAN公司);生物氧特性微機(jī)測(cè)量分析儀 (北京空軍第六裝備研究所);DY89—Ⅱ型電動(dòng)勻漿機(jī) (寧波新芝);759紫外分光光度計(jì) (浙江福立分析儀器有限公司)。
沙棘脂肪酸組成分 (由西安交大天奎醫(yī)藥生物公司提供,批號(hào) 20040605。取內(nèi)容物為4.50g/kg、2.25g/kg、1.125g/kg乳劑);已烯雌酚 (天津力生制藥股份有限公司,產(chǎn)品批號(hào)0401200,溶于同種賦形劑制成0.02mg/kg乳劑);賦形劑為0.72g/kg的伯洛沙姆。
EDTA-2Na、ATP-2Na(Amresco公司);氯化鎂 (上海生工生物工程有限公司);維生素C、琥珀酸鈉、蘋果酸、琥珀酸、硼氫化鈉、細(xì)胞色素 C、魚藤酮、抗霉素A、CoQ10、蔗糖(Sigma公司);2,6-二氯酚靛酚 (2,6-DCPIP)(Fluka公司);琥珀酸脫氫酶、ATP酶測(cè)試盒、總蛋白測(cè)試盒、總蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、磷測(cè)試盒 (南京建成生物工程研究所);其余生化試劑均為分析純。
健康20月齡Wistar雌性大鼠63只,質(zhì)量(300±12)g,由北京中科院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)均分為5組:沙棘脂肪酸組成分 (以下簡(jiǎn)稱天癸)高、中、低劑量組、雌激素組、老年對(duì)照組;另將13只6月齡雌性大鼠為青年空白對(duì)照組。
大鼠按0.01ml/kg體重每天定時(shí)灌胃給藥,各組劑量如下:天癸高、中、低劑量組依次為4.50g/kg、2.25g/kg、1.125g/kg;雌激素組給予已烯雌酚0.02mg/kg。青年及老年對(duì)照組給予賦形劑。連續(xù)給藥90d停藥,空腹12h后,麻醉,取樣。
動(dòng)脈插管取血約2ml,室溫靜置2h,離心取上清,分裝后-20℃冰箱保存。迅速開腹,取肝臟,冰浴條件下制備肝勻漿,0℃高速提取線粒體,部分用于測(cè)定線粒體呼吸功能,其余分裝后-20℃保存。
線粒體呼吸控制率 (RCR)、磷氧比 (P/O)及氧化磷酸化效率 (OPR)采用Clarck氧電極法測(cè)定線粒體呼吸功能各項(xiàng)指標(biāo)[2]。
線粒體復(fù)合酶活性:按Veitch等的方法分別測(cè)定復(fù)合酶Ⅰ~Ⅳ活性[3]。
線粒體ATP合成酶活性:用無(wú)機(jī)磷檢測(cè)試劑盒測(cè)定Pi含量以代表ATP酶活性。線粒體ATP合成酶是一種可逆性酶,當(dāng)ATP量遠(yuǎn)多于ADP時(shí),ATP合成酶分解ATP成ADP和無(wú)機(jī)磷,測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量,可計(jì)算ATP合成酶的活性。
線粒體Ca2+-ATP酶活性:按照ATP酶測(cè)試盒說(shuō)明操作。
線粒體琥珀酸脫氫酶活性:按照琥珀酸脫氫酶試劑盒說(shuō)明操作。
應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS11.5進(jìn)行單因素方差分析。
各組大鼠基本狀況良好,用藥2周以后背毛變得有光澤,絨毛感增強(qiáng),行動(dòng)自如,未見(jiàn)其他異常表現(xiàn);老年對(duì)照組大鼠行動(dòng)較為遲緩,毛色粗糙成束,脫毛現(xiàn)象比較普遍,老年特征明顯。
與老年組相比,青年組及天癸高、中劑量組復(fù)合酶Ⅰ明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05);青年組復(fù)合酶Ⅱ活性高于老年組 (P<0.05);沙棘脂肪酸實(shí)驗(yàn)組及雌激素組比老年對(duì)照組酶活性升高;青年組、沙棘脂肪酸高、中劑量組及雌激素組復(fù)合酶Ⅲ活性顯著高于老年組(P<0.01或P<0.05,);與老年組相比,青年組和雌激素組復(fù)合酶Ⅳ活性顯著升高 (P<0.01或P<0.05);沙棘脂肪酸組成分高中低劑量實(shí)驗(yàn)組復(fù)合酶Ⅳ活性高于老年組呈升高趨勢(shì),詳見(jiàn)表1。
表1 大鼠線粒體復(fù)合酶Ⅰ-Ⅳ活性測(cè)定結(jié)果(nmol.mg-1.min-1,x±s)
與老年組比較,青年組、沙棘脂肪酸實(shí)驗(yàn)組及雌激素組OPR升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01或P<0.05);青年組、沙棘脂肪酸中劑量組和雌激素組ADP/O比值高于老年組 (P<0.01或P<0.05);與老年組比較,青年組和雌激素組RCR(P<0.05)、沙棘脂肪酸高中低實(shí)驗(yàn)組RCR值升高 (P>0.05)但呈升高趨勢(shì),詳見(jiàn)表2。
表2 各組大鼠線粒體呼吸功能測(cè)定結(jié)果(nmol.mgprot-1.min-1,±s)
表2 各組大鼠線粒體呼吸功能測(cè)定結(jié)果(nmol.mgprot-1.min-1,±s)
注 與老年對(duì)照組比較 *P<0.05,**P<0.01。
組 別 劑 量(g/kg) n RCR ADP/O OPR脂肪酸高劑量 4.50 9 1.57±0.27 1.87±0.49 41.07±10.20*脂肪酸中劑量 2.25 9 1.59±0.34 1.96±0.65* 42.30±12.27*脂肪酸低劑量 1.125 10 1.47±0.32 1.87±0.45 39.32±10.85*雌激素 0.02×10-3 13 1.67±0.64* 1.96±0.58* 41.47±10.00*老年對(duì)照 等體積 9 1.26±0.19 1.45±0.22 25.07±4.54青年對(duì)照 等體積 11 1.73±0.39* 2.02±0.82** 46.18±13.39**
與老年組比較,沙棘脂肪酸實(shí)驗(yàn)組高、中、低劑量組和青年組 ATP合成酶活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)。雌激素組ATP合成酶活性 (P>0.05)見(jiàn)表3。
表3 各組大鼠線粒體ATP合成酶活性測(cè)定結(jié)果 (μ mol.mg-1.hour-1,±s)
表3 各組大鼠線粒體ATP合成酶活性測(cè)定結(jié)果 (μ mol.mg-1.hour-1,±s)
注 與老年對(duì)照組比較 *P<0.05,**P<0.01。
組 別 劑 量(g/kg) n ATP合成酶活性脂肪酸高劑量 4.50 12 0.31±0.04*脂肪酸中劑量 2.25 12 0.31±0.05**脂肪酸低劑量 1.125 13 0.29±0.08*雌激素 0.02×10-3 14 0.28±0.06老年對(duì)照 等體積 12 0.24±0.04青年對(duì)照 等體積 13 0.34±0.07**
與老年組比較,天癸高、中劑量組及青年組Ca2+-AT P酶活性明顯升高,差異顯著 (P<0.01),其中沙棘脂肪酸高、中劑量組與青年組接近。雌激素組Ca2+-ATP酶活性 (P>0.05)見(jiàn)表4。
與老年組比較,青年組酶活性顯著升高 (P<0.05),沙棘脂肪酸實(shí)驗(yàn)組SDH酶活性呈升高趨勢(shì),尤其是高劑量組升高值遠(yuǎn)高于老年組和雌性激素組,見(jiàn)表5。
表4 各組大鼠線粒體Ca2+-ATP酶活性測(cè)定結(jié)果(μmol.mg-1.hour-1, ±s)
表4 各組大鼠線粒體Ca2+-ATP酶活性測(cè)定結(jié)果(μmol.mg-1.hour-1, ±s)
注 與老年對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01。
組 別劑 量(g/kg)nCa2+-ATP酶活性脂肪酸高劑量4.50120.29±0.04**脂肪酸中劑量2.25120.29±0.04**脂肪酸低劑量1.125120.25±0.04雌激素0.02×10-3130.24±0.03老年對(duì)照等體積120.22±0.04青年對(duì)照等體積120.30±0.05**
表5 各組大鼠琥珀酸脫氫酶活性測(cè)定結(jié)果(U.mg-1.hour-1, ±s)
表5 各組大鼠琥珀酸脫氫酶活性測(cè)定結(jié)果(U.mg-1.hour-1, ±s)
注 與老年對(duì)照組比較 *P<0.05,**P<0.01。
組 別 劑 量(g/kg) n 琥珀酸脫氫酶活性脂肪酸高劑量 4.50 12 4.21±0.67脂肪酸中劑量 2.25 12 4.09±1.15脂肪酸低劑量 1.125 13 3.54±0.96雌激素 0.02×10-3 14 3.77±1.15老年對(duì)照 等體積 12 3.50±1.02青年對(duì)照 等體積 13 4.52±1.17*
研究結(jié)果揭示,沙棘脂肪酸組成分可能對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ~Ⅳ的質(zhì)子泵起作用,并促進(jìn)線粒體呼吸鏈傳遞電子過(guò)程。本動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí),沙棘脂肪酸組成分不僅改善了線粒體內(nèi)膜復(fù)合酶Ⅰ~Ⅳ活性功能,使AT P合成酶生成顯著性增加,更重要的是藥物調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì)和輔酶成分,增強(qiáng)了機(jī)體的生物能量的轉(zhuǎn)換作用。本次試驗(yàn)與前期的研究進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析顯示:沙棘脂肪酸組成分增強(qiáng)了復(fù)合酶Ⅰ~Ⅳ、ATP合成酶活性功能,激活了機(jī)體環(huán)核甘酸CAMP/CGMP第二信使,并產(chǎn)生生物功能的集合放大作用;調(diào)整了老齡雌性大鼠因衰老所致血清中的CAMP/CGMP濃度比值紊亂;并激活機(jī)體CAMP/PKA、Ca2+-ATP酶活性的信號(hào)調(diào)節(jié)通路[4]。
隨著年齡的增加,人的肝臟和骨骼肌中及其他組織中表現(xiàn)為線粒體的呼吸鏈的氧化代謝功能下降,氧化磷酸化效率降低,線粒體的結(jié)構(gòu)受到破壞,呼吸鏈組成酶類和AT P的合成效率下降現(xiàn)象[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
Ca2+作為普遍存在的細(xì)胞內(nèi)第二信使,在細(xì)胞生命活動(dòng)中起到重要作用。隨著年齡的增加,細(xì)胞內(nèi)Ca2+呈漸進(jìn)性增加。細(xì)胞內(nèi)鈣超載對(duì)線粒體及能量代謝產(chǎn)生消極影響。細(xì)胞內(nèi)游離鈣病理性增加之后,則需要細(xì)胞內(nèi)的Ca2+調(diào)控機(jī)制發(fā)揮作用,以維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。Ca2+-ATP酶在Ca2+的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。但研究發(fā)現(xiàn),隨著老齡化的發(fā)生,細(xì)胞內(nèi)的Ca2+調(diào)控能力是逐漸衰退的,細(xì)胞膜鈣泵活性隨著年齡增加而顯著降低,外排Ca2+的能力明顯下降[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,天癸實(shí)驗(yàn)組Ca2+-ATP酶活性都顯著高于老年組,線粒體細(xì)胞膜鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高,可以緩解細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載狀態(tài)。這與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果藥物實(shí)驗(yàn)組線粒體內(nèi)游離鈣離子濃度明顯低于老年組相一致。
琥珀酸脫氫酶既是三羧酸循環(huán)的限速酶之一,又是線粒體內(nèi)膜的標(biāo)志酶。它的作用對(duì)肝細(xì)胞的觀察發(fā)現(xiàn),由核編碼的琥珀酸脫氫酶活性在衰老時(shí)沒(méi)有明顯的變化[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,老年組SDH活性與青年組比較無(wú)顯著性下降,沙棘脂肪酸組成分服藥組,其衰老大鼠下降的SDH活性含量達(dá)到改善并有升高趨勢(shì)。其SDH在體內(nèi)三羧酸循環(huán)中是通過(guò)輔酶與脫氫酶結(jié)合形成變位酶的作用而改變琥珀酸的活性,還是SDH在體內(nèi)代表獨(dú)立的催化實(shí)體起作用有待于在以后的實(shí)驗(yàn)研究中加以證實(shí)。
綜上所述,沙棘脂肪酸組成分以線粒體作為抗衰老調(diào)控靶標(biāo),是因?yàn)榫€粒體參與人體三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、脂肪酸分解、電子傳遞、能量轉(zhuǎn)換、DNA復(fù)制和 RNA合成等生命運(yùn)動(dòng)的過(guò)程。沙棘脂肪酸組成分具有增強(qiáng)線粒體內(nèi)膜蛋白輔酶活性,保護(hù)線粒體功能的抗氧化損傷,促進(jìn)線粒體呼吸功能和氧化磷酸化功能,使線粒體的細(xì)胞新陳代謝功能 (放能、儲(chǔ)能、轉(zhuǎn)化能)得以在體內(nèi)進(jìn)行自主平衡性的調(diào)節(jié),而使DNA復(fù)制和 RNA合成得以正常進(jìn)行達(dá)到調(diào)節(jié)抗衰老目的。
[1] 周志東,趙偉康,金國(guó)琴.老年大鼠線粒體能量代謝及其調(diào)控的研究 [J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2001,21(3):208-210.
[2] 邱宏,金國(guó)琴,張學(xué)禮.調(diào)心方對(duì)氧化損傷型類AD大鼠能量代謝的影響[J].中藥藥理與臨床,2002,18(1):18-21.
[3] 熊杰,馮亦璞.丁基苯酞對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性的影響 [J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1999,34(4):241-245.
[4] Hu R,Yuan BX,Wei XZ.Enhanced CAMP/PKA pathway by seabucthorn fatty acid in Aged rats[J].Pharmacol Exp Ther,2007,10(1):248-254.
[5] 陳永紅,杜冠華.線粒體與衰老[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2000,16(5):485-488.
[6] 馬鐵明.脾氣虛證、脾陽(yáng)虛證和脾陰虛證老年大鼠模型心、腦組織中mtDNA缺失、呼吸鏈復(fù)合體酶活性的變化以及補(bǔ)益脾胃方藥作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)學(xué)院,2004,10(1):23-27.
[7] 鄭國(guó)锠.細(xì)胞生物學(xué) [M],4版.北京:高等教育出版社,2003:189-191.