戴文鑫 雷懷定 吳智勇 鄭 茵 陳 娟 馮光球

(海南省人民醫(yī)院留醫(yī)部省醫(yī)療保健中心四區(qū)，海南 海口 570311)

p53介導的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑與細胞內(nèi)其他信號轉(zhuǎn)導通路間存在著錯綜復雜的相互關系，不能獨立的衡量p53的生物學功能〔1〕，而應將各個與之相關的基因綜合起來研究其體系，信號轉(zhuǎn)導途徑中任何一個環(huán)節(jié)的障礙都將影響其功能，導致細胞周期失控、基因不穩(wěn)定、甚至腫瘤發(fā)生。雙微粒體2(murine double inute 2，MDM2)是一種進化上保守的癌基因，MDM2是目前研究比較廣泛的癌基因之一，在多種腫瘤中可以檢出，在功能上與p53基因密切相關。研究肺癌不同類型組織中MDM2蛋白增高表達率腺癌最高。2003年3月至2005年10月，本研究針對肺腺癌患者，通過癌組織中MDM2、p53表達的檢測，進行MDM2-p53通路的表達及其意義的探討。

1 資料與方法

1.1 標本 41例肺腺癌標本均取自湖北十堰太和醫(yī)院呼吸內(nèi)科2003～2005年支氣管鏡下活檢組織。41例病例中，男24例，女17例，年齡23～71歲，均為首次確診病例，確診前未行化療、放療和其他生物免疫治療;TNM分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期11例，Ⅲ期12例，Ⅳ期13例。所有標本均經(jīng)10%甲醛溶液浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋保存。

1.2 試劑 一抗分別為1∶100稀釋的鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人MDM2單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體(均為Santa Cruz Biotechnology，Inc產(chǎn)品)。用PBS代替一抗做陰性對照;10%封閉用正常山羊血清、生物素化二抗工作液、抗辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵蛋白素及DAB顯色試劑盒均購自Dako公司。原位細胞凋亡檢測試劑盒(POD)為美國羅氏公司原裝試劑盒，購自天津津脈基因測繪技術(shù)有限公司。

1.3 方法 按免疫組化SP法進行。已知陽性片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。細胞凋亡檢測采用TUNEL法。

1.4 結(jié)果判定 PCNA的陽性著色部位在胞核，PCNA染色以細胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒為陽性細胞。光鏡下取10個細胞密集的高倍鏡視野(400×)，計數(shù)1 000個腫瘤細胞中陽性細胞的百分率即增殖指數(shù)(LI)。凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核中有棕黃色顆粒，同時伴有細胞縮小變圓、核致密、新月體和凋亡小體出現(xiàn)等改變。光鏡下隨機觀察10個高倍鏡，計數(shù)1 000～2 000個腫瘤細胞，計算凋亡細胞占全部腫瘤細胞的比例即為凋亡標記指數(shù)(ALI)，以百分率表達。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料計數(shù)用表示，計量資料比較用χ2檢驗。相關性分析采用直線相關回歸。

2 結(jié)果

2.1 MDM2在肺腺癌不同臨床分期中的表達 MDM2在肺腺癌表達陽性率為31.71%(13/41)。其中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺腺癌陽性表達率分別為 46.15%、30.00%、28.57%、25.00%，各組間比較差異顯著(P＜0.05)。

2.2 p53在肺癌不同臨床分期的表達 p53在肺腺癌中表達陽性率為53.65%(22/41)。其中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺腺癌陽性表達率分別為20.00%、45.45%、54.55%、71.42%，各組間比較差異顯著(P＜0.05)。

2.3 p53和MDM2的關系 在對41例患者MDM2和p53的染色結(jié)果對比后發(fā)現(xiàn)，兩種染色均為陽性者7例，均為陰性者13例。結(jié)果見表1。進一步研究將p53染色陽性的切片分成高表達組和低表達組進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53高表達組肺腺癌細胞的MDM2為9.58% ±2.16%，低表達組肺腺癌細胞的MDM2為22.81% ±5.78%，兩組差異顯著(P＜0.05)。p53和MDM2的表達之間存在相關性(P＜0.05)。

表1 各標本p53基因表達與MDM2基因表達例數(shù)(n)

2.4 p53、MDM2表達與腫瘤原發(fā)灶大小之間的關系 原發(fā)灶≥3.0 cm者，p53表達為33.43% ±7.28%，＜3.0 cm者p53為6.61% ±1.34%，二者間統(tǒng)計學有顯著差異(P＜0.01)。原發(fā)灶≥3.0 cm者，MDM2為 3.77% ±1.13%，＜3.0 cm者MDM2為24.53% ±4.13%，二者差異顯著(P＜0.05)。

2.5 p53、MDM2表達量高低與肺腺癌細胞增殖、凋亡之間的關系 p53高表達組肺腺癌細胞的PCNA LI為33.13%±4.65%，低表達組肺腺癌細胞的PCNA LI為16.48% ±5.21%，兩組存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05);p53高表達組肺腺癌細胞的ALI為 1.34% ±0.12%，低表達組肺腺癌細胞的 ALI為1.36% ±0.09%，兩組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。MDM2高表達組肺腺癌細胞的PCNALI為23.32% ±0.54%，低表達組肺腺癌細胞的PCNALI為22.99% ±0.07%，兩組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);MDM2高表達組肺腺癌細胞的ALI為1.27%±0.08%，低表達組肺腺癌細胞的 ALI為1.31% ±0.15%，兩組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

3 討論

肺癌的發(fā)生是一個多基因參與的多步驟的復雜過程，從腫瘤細胞學來看，肺癌發(fā)生的本質(zhì)在于細胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)失控，抑癌基因功能的喪失和癌基因的表達是腫瘤發(fā)生的主要原因。抑癌基因p53由于含有一段序列專一性轉(zhuǎn)錄結(jié)合序列，作為轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)大量靶基因的表達，在調(diào)節(jié)細胞生長、分化、衰老、應激等生命過程中起著重要的調(diào)控作用，在正常細胞中表達量極低，但是當細胞受到強有力的刺激后表達量急劇增加并被激活，從而影響細胞周期阻滯、凋亡、分化、靜息、損傷、及其他功能〔2，3〕。

p53介導的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑與細胞內(nèi)其他信號轉(zhuǎn)導通路間存在著錯綜復雜的相互關系，因此Vogelstein等〔1〕認為，不能獨立的衡量p53的生物學功能，而應將各個與之相關的基因綜合起來研究其體系，這些體系構(gòu)成的網(wǎng)絡就是p53的生物學功能網(wǎng)絡。信號轉(zhuǎn)導途徑中任何一個環(huán)節(jié)的障礙都將影響其功能，導致細胞周期失控、基因不穩(wěn)定、甚至腫瘤發(fā)生。MDM2是一種進化上保守的癌基因，位于染色體12 q13214，全長2.372 kb，編碼491個氨基酸組成的蛋白，人和鼠的各種組織中有廣泛表達，參與細胞的基本生理過程。MDM2的擴增與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移有密切關系。細胞內(nèi)野生型p53蛋白濃度取決于其降解的速度而不是其生成的速度。其中調(diào)節(jié)p53表達和功能的負反饋環(huán)路是p53-MDM2通路。MDM2是 p53轉(zhuǎn)錄靶基因，p53誘導MDM2的表達，MDM2蛋白與p53結(jié)合后覆蓋其N端酸性活化區(qū)，形成MDM2-p53復合物，阻斷p53轉(zhuǎn)錄活性，使p53泛素化，可作為p53的E3泛素連接體;MDM2也對p53的轉(zhuǎn)錄活性有直接抑制作用，MDM2高水平的基因產(chǎn)物可使p53失活，促進p53降解，尤其對野生型p53結(jié)合力強，導致基因的不穩(wěn)定和細胞增生，表現(xiàn)出癌基因蛋白的作用，參與腫瘤形成〔4，5〕。p53在細胞內(nèi)低濃度又可減少 MDM2 基因轉(zhuǎn)錄，將p53-MDM2負反饋環(huán)路關閉，使p53回到維持正常功能狀態(tài)的水平。在應激情況下，對p53-MDM2的翻譯后調(diào)節(jié)、亞細胞再分布、抑制MDM2活性、直接抑制MDM2轉(zhuǎn)錄，使得p53快速積聚，防止細胞異常生長和惡性轉(zhuǎn)化〔6〕。MDM2是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)p53濃度及活性的重要蛋白質(zhì)，兩者構(gòu)成似電流環(huán)路中的負反饋，彼此相互進行精細的調(diào)節(jié)〔7〕。有研究顯示p53誘導MDM2基因轉(zhuǎn)錄，MDM2蛋白和p53結(jié)合促其失活及降解;突變型p53檢出率升高，MDM2檢出率下降〔8〕，表明p53/MDM2存在負反饋機制;也有研究表明，兩者的變化具有同向性，可能與突變型p53對 MDM2的穩(wěn)定性強，繼續(xù)刺激 MDM2產(chǎn)生有關〔9，10〕。我們的研究結(jié)果表明，MDM2、p53在肺腺癌各臨床分期的表達均有統(tǒng)計學差異，二者的表達之間呈負相關，支持p53/MDM2存在負反饋調(diào)節(jié)。p53與MDM2之間存在著錯綜復雜的相互作用與負反饋機制，使得p53的網(wǎng)絡體系更加協(xié)調(diào)和精確。我們的研究表明p53和MDM2的表達和腺癌的臨床分期、原發(fā)灶大小相關。p53和腫瘤的增殖活性有關而MDM2與之無關，二者均與凋亡指數(shù)無關，說明MDM2沒有參與腫瘤的高增殖，而p53在肺腺癌的高增殖中起著重要作用。另外還發(fā)現(xiàn)二者并非均為正協(xié)調(diào)作用，又存在著負協(xié)調(diào)作用，如大腺癌中p53的表達低而MDM2的表達高，這說明二者各自還存在獨立作用機制，正是p53和MDM2相互作用的復雜性導致了肺腺癌在不同發(fā)展階段的復雜表現(xiàn)。

我們的研究表明如果能抑制p53或/和MDM2的表達，就可以阻斷MDM2-p53通路，從而抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。對肺癌進行MDM2、p53檢測分析將有利于進一步探討肺癌發(fā)生的作用機制，為肺癌的預防、診斷、治療提供理論依據(jù)。

1 Vogelstein B，Lane D，Levine AJ.Surfing the P53 net work〔J〕.Nature，2000;408:307-10.

2 Kato S，Han SY，Liu W，et al.Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by highresolution missense mutation analysis〔J〕.PNAS，2003;100:8424-9.

3 Achison M，Hupp TR.Hypoxia attenuates the p53 response to cellular damage〔J〕.Oncogene，2003;22:3431-40.

4 Buschmann T，F(xiàn)uchs SY，Lee Cg，et al.SUMO-1 modification of MDM2 prevents its self-ubiquitination and increases Mdm2 ability to ubiquitinate p53〔J〕.Cell，2000;101:753-62.

5 Chne P.Inhibiting the p53-mdm2 interaction:an important target for cancer therapy〔J〕.Nat Rev Cancer，2003;3(2):102-9.

6 Ryan KM，Phillips AC，Vousden KH.Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein〔J〕.Curr Opin Cell Biol，2001;13(3):332-7.

7 Lahav G，Rosenfeld N，Sigal A，et al.Dynamics of the p53-MDM2 feedback loop in individual cells〔J〕.Nat Genet，2004;36(2):147-50.

8 Martha L，Simmon S，Kathleen R，et al.Analysis of complex relationships between age，p53，epidermal growth factor receptor，and survival in glioblastoma patients〔J〕.Cancer Res，2001;61:1122-8.

9 孫艷花，鐘雪云，陳運賢，等.星形細胞瘤中MDM2、p53的表達及調(diào)控機制探討〔J〕.腫瘤防治研究，2004;31(8):477-9.

10 LeBron C，Chen L，Gilkes DM，et al.Regulation of MDMX nuclear import and degradation by Chk2 and 14-3-3〔J〕.EMBO J，2006;2225(6):1196-206.