閆翠環(huán) 方 敬 陳志強 甄彥君 陳金金 劉云肖 姜秀娟 (河北醫(yī)科大學(xué),河北 石家莊 05009)

前期研究已經(jīng)證實,腎舒康能降低尿蛋白、減輕腎組織病理損傷、保護(hù)腎功能〔1〕。本研究通過給白兔注射羊抗兔腎血清復(fù)制馬杉氏腎炎(MGN)動物模型,同時以中藥復(fù)方腎舒康進(jìn)行干預(yù)性治療,觀察腎舒康對MGN的治療作用及可能的機制,進(jìn)一步為臨床用藥提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級成年綿羊1只,雌性,體重25 kg,由解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供,實驗動物許可證號:SCXK(滬)2007-0003);健康新西蘭種大耳白兔40只,雄雌兼半,體重1.75～2.25 kg,由武漢市新州區(qū)全耀動物養(yǎng)殖場提供,實驗動物許可證號:SCXK(鄂)2004-0006。

1.1.2 藥物 腎舒康合劑(由黃芪、黃精、白花蛇舌草、地龍、川芎、積雪草、柴胡、丹參、生地、石葦組成,藥材購自安國市一方中藥材有限公司,由河北省中醫(yī)院中藥房孟熙中藥師鑒定為真品)由河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院提供;雷公藤多苷(湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司,批號:20050702)。

1.1.3 主要儀器與試劑 HMIAS-2000型醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司);ZEISS熒光顯微鏡,HM340E型石蠟切片機(德國ZEISS公司)。280型血流變儀(北京中勤試劑有限公司);722型火焰分光光度計(山東高密彩虹分析儀器廠)。弗氏完全佐劑(Sigma公司,批號:Lot102K8930)。

1.2 方法

1.2.1 白兔MGN模型制備和分組 按傳統(tǒng)方法〔2〕制備羊抗兔腎血清,將所有白兔隨機分為正常、模型、腎舒康、雷公藤多苷組。除正常組外,其他各組白兔均經(jīng)耳緣靜脈注射羊抗兔腎血清,每次2 ml,間隔0.5 h注射1次,共6次。檢測尿蛋白呈陽性反應(yīng),表明MGN模型復(fù)制成功〔3〕。

1.2.2 給藥 復(fù)制模型成功后第1天開始灌胃給藥,1次/d。腎舒康成人每日用量為黃芪15 g、黃精15 g、生地 15 g、丹參30 g、川芎15 g、石葦 15 g、白花蛇舌草15 g、積雪草 15 g、柴胡10 g、地龍15 g。配伍組方后,砂鍋熬制成煎劑。成人生藥用量為160 g/d,按動物系數(shù)表(B種動物的劑量·mg-1·kg-1=換算系數(shù) ×A種動物的劑量·mg-1·kg-1)折算,白兔的有效生藥劑量為8.16 g·kg-1·d-1。各組用藥量分別為:腎舒康組8.16 g·kg-1·d-1(生藥),雷公藤多苷組5 mg·kg-1·d-1,模型和正常組給予等容量生理鹽水,灌胃給藥,1次/d,連續(xù)4 w。

1.2.3 標(biāo)本制備與指標(biāo)檢測 ①所有觀察對象均于給藥4 w后第1天上午8:00～8:30空腹抽取靜脈血4 ml,以肝素30 U/ml抗凝,并在 2 h內(nèi)檢測全血黏度 (η b,高切、低切)、血漿黏度(η p)、纖維蛋白原(Fig)、血細(xì)胞比容(HCT)。②于用藥后4 w末殺檢動物,取部分腎組織,4%多聚甲醛溶液固定,酒精梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,以 3 μ m 的石蠟切片,行Masson染色,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍片。③取部分腎組織制成冰凍切片,進(jìn)行間接法免疫熒光檢測并拍片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,計量數(shù)據(jù)以±s表示,用單因素方差分析法對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔血液流變學(xué)指標(biāo)比較 模型組 η b(200 s-1、5 s-1)、η p、Fig、HCT 與正常組相比均顯著升高 (P ＜0.01),提示家兔在造模后出現(xiàn)高凝狀態(tài);腎舒康組和雷公藤多苷組與模型組相比,η b(200 s-1、5 s-1)、η p、Fig、HCT 均明顯降低(P ＜0.01);兩治療組相比,腎舒康組的各項指標(biāo)均略低于雷公藤多苷組,但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 各組白兔光鏡觀察比較 模型組基底膜重度彌漫性增厚,系膜基質(zhì)增多,膠原纖維增生,可見局灶節(jié)段性腎小球硬化。腎小球囊壁層細(xì)胞增生,有大量炎性細(xì)胞浸潤;間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤,可見散在的纖維增生。腎舒康組基底膜增厚較模型組輕,腎小球囊內(nèi)壁光滑,間質(zhì)纖維組織增生不明顯,僅見少量炎性細(xì)胞浸潤。雷公藤多苷組動物腎組織形態(tài)變化與腎舒康組基本相似,但膠原纖維增生程度較腎舒康組略重。見圖1。

2.3 各組白兔免疫熒光比較 模型組可見免疫球蛋白G(IgG)沿基底膜和系膜線狀排列,熒光強度較強。腎舒康組和雷公藤多苷組偶見IgG沿基底膜線狀排列,熒光強度明顯減弱,各組均未見補體C3。見圖2。

表1 各組家兔血液流變學(xué)比較(±s,n=10)

表1 各組家兔血液流變學(xué)比較(±s,n=10)

與正常組比較:1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.01

組別 n η b(200 s-1 mPa·s) η b(5 s-1mPa·s) η p(mPa·s) Fig(g/L) HCT(%)正常組 10 3.51±0.29 7.72±0.30 1.35 ±0.065 1.27±0.14 0.40 ±0.04模型組 8 5.23±0.58 2) 11.38 ±1.092) 2.02±0.26 2) 2.10 ±0.322) 0.60±0.082)腎舒康組 10 4.43±0.46 2)3) 10.22 ±0.692)3) 1.52±0.11 1) 1.53±0.201)3) 0.50 ±0.052)3)雷公藤多苷組 10 4.52±0.51 2)3) 10.37±0.682)3) 1.60±0.122)3) 1.59±0.182)3) 0.52±0.062)3)

圖1 各組病理切片(Masson,×400)

圖2 各組免疫熒光圖片(熒光,×400)

3 討 論

MGN是一種典型的抗腎小球基底膜性腎小球腎炎,其病理變化為滲出及增殖性改變,與人類此種腎炎病理改變相近,是較理想的腎炎模型;其主要臨床表現(xiàn)為腎病綜合征(NS),隨著疾病的發(fā)展甚至?xí)鹉I功能的嚴(yán)重?fù)p傷〔4〕。對于NS,目前臨床多采用激素類、免疫抑制劑等藥物進(jìn)行治療,但隨著患者年齡增大、人體免疫組織功能減退、激素水平下降,導(dǎo)致機體對激素的敏感性降低;中老年組病人中血管硬化逐漸加重,腎動脈硬化導(dǎo)致腎功能惡化,降低對激素的療效;中老年病人中較多合并或伴有其他全身性疾病,如高血壓、糖尿病,限制了激素臨床應(yīng)用,降低了激素的療效。所以其療效除與病理分型有關(guān)外,尚與患者年齡大小有關(guān)〔5〕,故不受年齡限制、低毒副作用的藥物成為研究的重點。

腎舒康是按NS脾腎功能失調(diào)、陰陽氣血不足,水濕、濕熱、瘀血阻滯的病機特點擬定的,本方由黃芪、黃精、生地、丹參、川芎、石葦、白花蛇舌草、積雪草、柴胡、地龍10味中藥組成,共奏健脾補腎、活血化瘀、清熱利濕之功效。

方中黃芪、黃精、生地為君藥,共奏健脾補腎、益氣養(yǎng)陰之功效,三藥合用,健脾溫中而不燥,益腎養(yǎng)陰而不膩,并助諸藥之力,使氣旺以促血行,祛瘀而不傷正;丹參、川芎、地龍、柴胡為臣藥,具有活血化瘀通絡(luò)、調(diào)暢氣血運行的功效,本方中柴胡配川芎可以氣血同治,相互協(xié)同以暢行氣血;積雪草、白花蛇舌草、石葦為佐使藥,三味藥配伍,共同發(fā)揮清熱利濕、解毒消腫的作用。

腎損傷及腎小球腎炎患者不論是否合并腎衰竭,均存在血液流變學(xué)改變。NS的高凝狀態(tài)主要因大量蛋白從尿中排出及代償性肝臟合成蛋白增加,引起凝血、抗凝、纖溶系統(tǒng)成分改變及血小板功能紊亂所致。激素和利尿劑的長期大量使用等原因也可導(dǎo)致明顯的血液高凝狀態(tài)〔6〕,故活血化瘀在NS治療中存在一定的重要性和必要性〔7〕?，F(xiàn)代藥理研究證實黃芪可降低血小板的聚集性,增強紅細(xì)胞的變形能力,緩解高凝狀態(tài),并能改變血瘀時的血流狀態(tài),疏通微循環(huán),保護(hù)腎功能〔8〕。丹參用于腎病治療主要功能體現(xiàn)在改善腎臟微循環(huán)〔9〕方面,丹參活血化瘀能改善微循環(huán)障礙,增加腎組織血流量,調(diào)節(jié)血液流變性,抑制血小板的聚集,降低血液黏稠度。川芎所含主要有效成分為川芎嗪和阿魏酸等,具有清除氧自由基、擴血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用,可擴張腎小血管,降低腎內(nèi)壓,改善腎血流灌注。地龍有抗凝、抗血栓作用,能降低血液的黏度,抑制血栓形成,還具有促纖溶作用,能使已形成的血栓溶解。地龍水煎液可降低血中HCT值,延長凝血時間,增加微血管口徑及開放數(shù),改善微循環(huán)。白花蛇舌草有清熱除濕、活血止痛等功效,其含有的總黃酮具有增強機體特異性免疫功能和非特異性免疫功能的作用,亦可以刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)增生,增強吞噬細(xì)胞活力而達(dá)到抗菌消炎作用〔10〕。與黃芪、黃精、生地、石葦配伍還可增加機體非特異性免疫力,促進(jìn)機體誘生干擾素的能力,減少免疫復(fù)合物(IC)的沉積,減輕免疫性因素對血管內(nèi)皮的損傷而發(fā)揮對腎組織的保護(hù)作用。

實驗結(jié)果顯示,腎舒康合劑能明顯改善腎血流動力學(xué)異常,緩解高凝狀態(tài)帶來的腎臟損害,并能減少IC在GBM的沉積,減輕由于IC沉積所造成的一系列病變,延緩腎組織的病變進(jìn)程,對MGN家兔起到了明顯的治療作用。其機制可能為以下幾點:①改善血液流變學(xué),降低血液黏度、血漿黏度和HCT水平,同時可預(yù)防血栓的形成;②改善血流動力學(xué),增加動脈血流量,降低血管阻力;③改善微循環(huán),解除微血管痙攣,增加微血管血流,降低毛細(xì)血管通透性,減少毛細(xì)血管滲血,促進(jìn)腎小球修復(fù)和再生。

1 韓 琳,張邊江,陳志強 .腎舒康對家兔 C-BSA腎炎模型治療作用的研究〔J〕.河北中醫(yī)藥學(xué)報,2006;12(3):5-7,26.

2 閆翠環(huán),方 敬,王艷素,等.腎舒康合劑對馬杉氏腎炎白兔腎功能的影響〔J〕.中國藥房,2011;22(15):1351-3.

3 桂常青,洪宗元,楊介人,等.家兔Masugi腎炎模型的制備及應(yīng)用茶多酚治療的療效觀察〔J〕.中國藥理學(xué)通報,1998;14(5):467-9.

4 王海燕.腎臟病學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:531-2.

5 施蓮珍,姚能才 .激素治療腎病綜合征的療效與年齡的關(guān)系〔J〕.河北醫(yī)學(xué),1998;4(2):85.

6 王海燕.腎臟病學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:947.

7 葉任高.中西醫(yī)結(jié)合腎臟病學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:208-48.

8 徐巨海,周 蓉,杜麗麗,等 .黃芪注射液對腎病綜合征患者血小板活化功能的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2002;3(4):225-30.

9 呂 勇,王億平,李文娟,等 .慢性腎衰竭血瘀證患者血清NO、ET、IL-6的水平變化及雷氏丹參片干預(yù)作用的臨床研究〔J〕.中成藥,2006;28(1):63-7.

10 陳 雅,楊坤星 .白花蛇舌草的化學(xué)成分及臨床應(yīng)用〔J〕.中國藥業(yè),2008;17(5):62-3.