廖 燕 林書瀚 黎丹戎 利基林 唐東平 唐 凱 張力圖

SLC30A9(solute carrier family 30 member 9)又名GAC63，是一個與DNA修復(fù)相關(guān)的基因［1］，其大部分功能未知。SLC30A9定位于4p13，在以往的研究中，大約50%膀胱癌被證實在4p13的4個區(qū)域存在雜合性缺失［2］，在其它的人類腫瘤包括子宮頸癌［3］、胃腺癌［4］和 BRCA1突變的腫瘤中［5］，通過掃描腫瘤組織染色體區(qū)域發(fā)現(xiàn)，4號染色體短臂存在頻繁的雜合性缺失，提示該區(qū)域的基因可能與腫瘤的發(fā)病有關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)，SLC30A9可以與β-catenin相互作用，影響Wnt信號通路的激活［6］，而Wnt信號通路與多種腫瘤的發(fā)展相關(guān)［7］。我們從生物信息學(xué)分析得到SLC30A9在乳腺癌組織和正常乳腺組織中存在差異性表達，因此，本研究以RT-PCR技術(shù)探討SLC30A9在乳腺癌組織中的表達情況，為進一步分析SLC30A9與腫瘤發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象與標(biāo)本保存

30例乳腺癌標(biāo)本取自2004年12月至2005年6月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院的手術(shù)病例?；颊呔鶠榕裕挲g30～74歲，中位47歲。其中浸潤性導(dǎo)管癌25例，低分化腺癌2例，乳頭狀癌1例，黏液腺癌1例，導(dǎo)管內(nèi)癌1例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例。所有病例均經(jīng)病理檢查確診，分別收集30例乳腺癌癌灶組織、30例癌旁組織和10例相應(yīng)的正常乳腺黏膜組織(距離病灶5cm以上且無癌浸潤者)。期間還收集了20例乳腺良性病變組織。這些組織分別離體后，10min內(nèi)投入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

Trizol總RNA抽提試劑由Invitrogen公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Taq酶、RNAse-free水等試劑由Promega公司提供。引物設(shè)計采用Primer 5軟件設(shè)計，引物合成由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。儀器主要為美國PTC2000型多通道PCR儀、美國PE公司PX2型高性能PCR儀，美國Bio-Rad Gel DOC2000型凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3 RNA的提取

1.3.1 物品和試劑的特殊準(zhǔn)備:將清潔的金屬器械和泡酸晾干的玻璃器皿放入烤箱，180℃以上高溫烘烤5h，以滅活RNA酶，不耐高溫的塑料和橡膠制品用配好的1‰DEPC液浸泡12h以上，撈起裝盒、打包，高壓蒸汽滅菌后烘干備用。所用的溶液均用RNAsefree DEPC水配制。

1.3.2 抽提總RNA的步驟 利用TROZOL一步法提取。

1.3.3 總RNA的鑒定 測定RNA的濃度和純度:取5μl RNA液加入195μl Rnase-free DEPC水稀釋40倍，用雙光束紫外分光光度儀(超薄石英杯)測定λ260nm和λ280nm的吸光度值(OD值)，根據(jù)公式計算濃度CRNA(μg/ml)=OD260×40×40÷1 000，根據(jù)OD260/OD280比值反映RNA純度，所有樣本的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，說明提出的RNA純度較高，符合標(biāo)準(zhǔn)。

總RNA的電泳鑒定:用1%瓊脂糖凝膠電泳1h，瓊脂糖凝膠用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，觀察若有28S、18S兩條帶出現(xiàn)，5S條帶很微弱，加樣孔內(nèi)無明顯DNA殘留，說明所提取的總RNA符合要求。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 按照A3500型逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)實驗操作步驟進行。在進行逆轉(zhuǎn)錄前先去除RNA中可能存在的痕量DNA。

1.3.5 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 所用引物為:F-5'GCC AAT TGC ATG GGC CTT AGT TC 3'R-5'TGC CCT TAC TGA TCG GTC ATT CTC C 3'10μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為94℃變性30s、65℃復(fù)性30s、72℃延長1min，30次循環(huán)。

1.3.6 RT-PCR結(jié)果判定 1.6%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，凝膠電泳成像系統(tǒng)成像，測算出相應(yīng)的光密度比值(SLC30A9 mRNA與GAPDH mRNA之比)。凝膠電泳分析軟件(BIORAD公司Quantity one軟件)分析測定其光密度，各電泳條帶凈密度值按下列公式計算:凈密度值=(平均密度-背景密度)×面積。以所擴GAPDH密度作為內(nèi)參照，以目標(biāo)基因凈密度與GADPH凈密度的比值進行半定量比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS10.0 for windows軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)、計量資料分別做t檢驗和χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLC30A9 mRNA的表達水平

全組90例乳腺組織樣品中均有SLC30A9 mRNA表達。在30例乳腺癌患者中，5例(4、9、10、12號和13號)患者的癌組織、癌旁組織及正常組織中均存在SLC30A9基因mRNA差異性表達，占16.7%(5/30)。4、9號和12號患者的癌組織中，SLC30A9的表達比相應(yīng)的正常組織低，而10號和13號患者則表現(xiàn)出在癌組織中表達上調(diào)。SLC30A9 mRNA在乳腺癌組織、癌旁組織、正常乳腺組織和乳腺良性病變組織的表達情況。見圖1-3。

圖3 乳腺癌(T)、乳腺良性病變組織(B)SLC30A9基因mRNA表達的瓊脂糖電泳圖

從組間分析來看，SLC30A9基因mRNA在30例乳腺癌患者的癌組織、癌旁組織和10例正常乳腺組織及20例乳腺良性病變組織中均有表達。其平均光密度比值分別為0.443±0.247、0.427±0.253、0.405±0.209、0.547±0.190。上述4組分別兩兩比較，SLC30A9 mRNA表達水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 乳腺癌組織、癌旁組織和正常乳腺組織SLC30A9 mRNA表達水平比較)

表1 乳腺癌組織、癌旁組織和正常乳腺組織SLC30A9 mRNA表達水平比較)

組織類型 n SLC30A9 mRNA P乳腺癌組織 30 0.443±0.247乳腺癌癌旁組織 30 0.427±0.253正常乳腺組織 10 0.405±0.209乳腺良性病變組織 20 0.547±0.190＞0.05

2.2 乳腺癌組織SLC30A9 mRNA的表達與各臨床病理因素的關(guān)系

乳腺癌組織中SLC30A9 mRNA的平均光密度比值在不同年齡、臨床分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 SLC30A9 mRNA在癌組織中的表達與各臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

本研究利用半定量RT-PCR法對30例乳腺癌的癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織、10例正常乳腺組織和20例乳腺良性病變組織進行SLC30A9 mRNA表達水平的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC30A9基因mRNA在90例乳腺組織樣品中均有表達。對其平均光密度值進行比較，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。即從整體組間的比較來看，沒有差異性表達，提示SLC30A9對乳腺癌的發(fā)生不是一個主要的因素。但研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生是多個基因相互作用的過程，大多數(shù)涉及的基因只起著部分作用。在突變掃描的研究中，往往只在大量的目的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)極少部分的突變。因此，在篩選疾病基因的過程中我們更應(yīng)注重個體的差異。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)5例標(biāo)本在癌組織、癌旁組織及正常組織中存在表達異常，占16.7%(5/30)，其中，有3例癌組織SLC30A9的表達比相應(yīng)的正常乳腺組織低，而其他2例則表現(xiàn)出在癌組織中表達上調(diào)。實驗結(jié)果提示在這些標(biāo)本中存在有基因突變的可能，這有待于突變掃描的結(jié)果證實。也可能該基因的表達調(diào)控出現(xiàn)誤差，造成表達的不穩(wěn)定。提示SLC30A9基因可能不是乳腺癌主導(dǎo)基因，但有可能起部分作用或與其他因素共同作用。

將30例乳腺癌患者按不同年齡(是否≥45歲)、臨床分期的早晚(Ⅰ/Ⅱ期或Ⅲ/Ⅳ期)、病理類型(浸潤性導(dǎo)管癌、黏液腺癌、低分化腺癌、乳頭狀癌、導(dǎo)管內(nèi)癌)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移進行分組后，分別在不同組別間比較癌組織SLC30A9 mRNA表達水平，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。提示SLC30A9 mRNA與乳腺癌患者不同年齡、臨床分期、病理類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等無關(guān)。

由于我們發(fā)現(xiàn)在一些標(biāo)本中SLC30A9的表達有上調(diào)，而一些標(biāo)本中有下調(diào)，因此我們用生物信息學(xué)的方法分析基因的microRNA(miRNA)調(diào)控情況，發(fā)現(xiàn)在SLC30A9的3'端非翻譯區(qū)存在有miRNA的結(jié)合位點，這說明該基因可能受mRNA的調(diào)控。這提示我們需要做該基因的miRNA結(jié)合位點的掃描分析，觀察是否存在基因突變從而影響表達。目前發(fā)現(xiàn)，大約有30%的人類基因表達可以被miRNA調(diào)控，而miRNA的調(diào)控與腫瘤的發(fā)生相關(guān)［8～10］。有關(guān)方面值得深入研究。

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