趙冰冰 張 瑋 李 力 陽志軍

2002年，Shin等［1］應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase，GST)融合蛋白技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種C2H2型鋅指蛋白，該蛋白可以與腫瘤壞死因子相關(guān)因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6)結(jié)合并對TRAF-6起抑制作用，因此將此鋅指蛋白命名為TIZ(TRAF-6 inhibitory znic finger protein)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TIZ蛋白在卵巢癌血清中表達(dá)率較卵巢良性患者和正常卵巢患者高，有可能作為卵巢癌診斷的標(biāo)志物［2］，但對于TIZ基因與卵巢癌的關(guān)系知之甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法檢測不同卵巢癌細(xì)胞株TIZ基因mRNA的表達(dá)水平，設(shè)計(jì)并篩選干擾效率較高的siRNA干擾片段構(gòu)建RNAi載體，為進(jìn)一步研究TIZ基因?qū)β殉舶┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

卵巢上皮癌鉑類敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV3和卵巢上皮癌鉑類耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP、A2780/CBP、SKOV3/DDP和 SKOV3/CBP(均為本試驗(yàn)室保存)［2］。Taq 酶購自 TAKARA 公司，Syber Green I購自上海捷瑞公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自三博遠(yuǎn)志公司。pTG19-T載體克隆載體購自上海捷瑞公司，pGPU6/GFP/Neo干擾載體購自吉瑪公司，LipofectamineTM2000購自 Invitrogen公司，Biospin Gel Extraction Kit膠回收試劑盒由Bioflux公司提供，DH-5α菌株為本試驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同卵巢癌細(xì)胞系中TIZ基因表達(dá)的測定采用RT-PCR方法。引物設(shè)計(jì):根據(jù)人類TIZ基因的mRNA序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物，TIZ基因引物序列如下:TIZ基因上游引物:5'-CTGCCACATTCTTTACATTTG-3，下游引物:5'-GTTGCACAAGGGAGGTTAT-3，引物擴(kuò)增片段為213bp。內(nèi)參基因β-actin上游引物:5'-GATGACCCAGATCATGTTTG-3，下游引物 antisense:5'-TGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3，引物擴(kuò)增片段為491bp，引物均由上海生物公司合成。細(xì)胞RNA提取采用Trizol一步法提取卵巢組織RNA，cDNA的合成采用RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司提供，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶由Promega公司提供)，實(shí)驗(yàn)操作按說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5min，變性94℃ 30s，復(fù)性57℃ 30s、延伸72℃ 30s，進(jìn)行 32 個(gè)循環(huán)后進(jìn)一步延伸72℃ 10min。取10μl PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 siRNA的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genebank上TIZ基因的mRNA序列設(shè)計(jì)5對siRNA并送上海吉瑪公司合成，其序列如下:

1.2.3 TIZ-siRNA干擾片段細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo) 采用脂質(zhì)體方法。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化、吹打均勻和細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)10cm2的培養(yǎng)瓶中種入約400 000個(gè)細(xì)胞，加入不含抗生素的1640培養(yǎng)液，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪滿率達(dá)到80%～90%，即進(jìn)行轉(zhuǎn)染;按每瓶 24μl(4.0μg)的DNA加入無抗生素、無血清1640培養(yǎng)基226μl，經(jīng)混勻后室溫孵育5min;按每瓶10μl Lipofectin TM2000 1640培養(yǎng)基240μl經(jīng)混勻后室溫孵育5min;將上述經(jīng)過孵育的兩種不同混合液混合后室溫孵育20min，將混合液加到細(xì)胞中;培養(yǎng)6h后棄混合液，加入含雙倍血清的1640培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;24h后更換正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～48h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 TIZ和β-actint mRNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)品的制備 TIZ和 β-actint mRNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)品制備采用pTG19-T重組質(zhì)粒。TIZ和β-actint mRNA表達(dá)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同前。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像分析系統(tǒng)觀察。PCR產(chǎn)物采用為Bioflux公司提供的Biospin Gel Extraction Kit膠回收試劑盒回收純化，并與pTG19-T質(zhì)粒載體連接，16℃反應(yīng)過夜后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5α制備的感受態(tài)，從37℃培養(yǎng)16～20h的DH-5α含氨芐抗性平皿中挑取陽性克隆，單克隆在LB培養(yǎng)液中37℃震蕩培養(yǎng)16～20h后進(jìn)行質(zhì)粒DNA的快速提取，PCR鑒定重組質(zhì)粒送生音公司測序，并在NCBI進(jìn)行BLAST結(jié)果序列對比分析，顯示與TIZ和β-actint基因的同源性達(dá)到100%。陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備，采用分光光度計(jì)進(jìn)行重組基因質(zhì)粒cDNA濃度測定并換算為拷貝濃度(copies/μl)，制備拷貝數(shù)依次相差10倍的標(biāo)準(zhǔn)品，即 109、108、107、106、105、104、103個(gè)/μl等。

1.2.5 TIZ-siRNA干擾片段細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)前后細(xì)胞系TIZ mRNA表達(dá)的測定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(QRT-PCR)。將5種siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后48h提取細(xì)胞總mRNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別進(jìn)行QRT-PCR擴(kuò)增。采用8連管平行建立QRT-PCR反應(yīng)體系，實(shí)驗(yàn)設(shè)細(xì)胞樣品擴(kuò)增目的基因TIZ和βactint各3管，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增目的基因TIZ和β-actint各2管和每空白對照(不含模板的反應(yīng)體系)各1管，3組在熒光定量PCR儀上同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系同前，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 2min，95℃ 30s，56℃30s，72℃ 40s，共 40 個(gè)循環(huán)，讀板 2sec，72℃ 10min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定量PCR儀自行數(shù)據(jù)分析，給出各個(gè)樣品的Ct值與SQ值(starting quantitiy)。結(jié)果判斷:以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的Ct值，讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的起始拷貝數(shù)，以此對每個(gè)樣品cDNA進(jìn)行定量分析。定量結(jié)果以SQ值表示。為了消除每個(gè)樣品反應(yīng)時(shí)cDNA量的不同，根據(jù)公式F:TIZ基因平均SQ值/β-actint基因平均SQ值來進(jìn)行校正，并獲得到各細(xì)胞TIZ基因的相對表達(dá)量。根據(jù)公式:基因沉寞率=(1-實(shí)驗(yàn)組/對照組)×100%，計(jì)算出各細(xì)胞TIZ基因沉寞率，以選擇干擾效率最高的siRNA片段構(gòu)建shRNA載體。

1.2.6 TIZsiRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建 采用pGPU6/GFP/Neo載體，將其酶切。并用1.0%低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行電泳。利用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。采用T4 DNA連結(jié)酶將純化后載體與退火的TIZ-573 siRNA、陽性和陰性進(jìn)行對照siRNA雙鏈插入片段進(jìn)行連接。并將含有αsiRNA片段質(zhì)粒的DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10后，37℃恒溫箱中平皿倒置培養(yǎng)16～20h過夜。然后在平皿挑選氨芐抗性克隆，分別接種于3ml LB(含 Amp100μg/ml)液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。采用Plasmid Mini Kit高純質(zhì)粒提取試劑盒小量提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送上海生物公司測序。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各卵巢癌細(xì)胞系中TIZ基因mRNA表達(dá)情況

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞HO8910細(xì)胞無TIZ基因mRNA表達(dá)，SKOV3、SKOV3順鉑耐藥、SKOV3卡鉑耐藥、A2780、A2780卡鉑耐藥細(xì)胞株等均有TIZ基因mRNA表達(dá)。結(jié)果見圖1。

圖1 TIZ基因在不同卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TIZ和β-actin mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線與融解曲線的建立

由圖2、圖3可見，TIZ和β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.991，表明曲線線性關(guān)系良好，用于分析樣品表達(dá)量的結(jié)果可信。融解曲線圖顯示基因擴(kuò)增成單峰，無雜峰，TIZ峰值位于84.5℃，βactin H峰值位于84.8℃(圖4、5)。

圖3 TIZ/pTG19-T質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線

2.3 TIZ-siRNA干擾片段細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)前后細(xì)胞系TIZ mRNA表達(dá)的測定

由表1可見，TIZ-siRNA 554、652和573干擾片段細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)后均可下調(diào)細(xì)胞TIZ mRNA表達(dá)，其中652和573干擾片段細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)后下調(diào)細(xì)胞TIZ mRNA表達(dá)相對拷貝數(shù)，與陽性對照組和陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中又以TIZ-573下調(diào)TIZ擴(kuò)增拷貝數(shù)最明顯。對TIZ-基因沉默率達(dá)60%。見圖8。

表1 轉(zhuǎn)染不同siRNA后QRT-PCR檢測TIZ基因拷貝數(shù)

圖6 不同siRNA對TIZ基因的抑制率

2.4 TIZsiRNA重組表達(dá)載體測序結(jié)果

將構(gòu)建好的TIZ-573siRNA、陽性對照siRNA、陰性對照siRNA分別送北京諾賽生物公司測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，將結(jié)果同源性達(dá)到97%以上送測序。TIZ基因干擾載體pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573測序結(jié)果見圖7。

圖7 pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573測序圖

3 討論

TIZ基因位于19q13上，C端有14個(gè)重復(fù)的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，因此也將此蛋白命名為鋅指蛋白675(ZNF675)。TIZN端(95aa～213aa)的鋅指結(jié)構(gòu)與TRAF-6 N端的環(huán)指結(jié)構(gòu)結(jié)合造成TRAF-6構(gòu)型的改變，抑制了TRAF-6對下游信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［3］。已有研究證實(shí)TRAF-6參與了多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子如NF-κB、JNK、C-FOS 等的活化［4～8］，進(jìn)而激活了如細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)等，這些細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程［8，9］。

至于TIZ基因在卵巢惡性腫瘤中發(fā)揮何種作用，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本課題前期通過構(gòu)建卵巢癌患者腹水腫瘤細(xì)胞cDNA文庫，采用改良的重組克隆表達(dá)抗原的血清學(xué)鑒定(SEREX)技術(shù)與抑制性消減雜交(SSH)方法相結(jié)合的策略，從文庫中篩選相關(guān)抗原基因 TIZ，采用重組腫瘤抗原的微量血清學(xué)檢測(SMARTA)法檢測TIZ抗原與卵巢癌患者和正常婦女的血清中相應(yīng)自身抗體的陽性反應(yīng)情況，結(jié)果示TIZ基因的重組抗原與卵巢癌患者血清中相應(yīng)IgM型自身抗體反應(yīng)的陽性率高于正常婦女血清反應(yīng)的陽性率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)［2］。因此，極有必要進(jìn)一步探討TIZ基因在卵巢惡性腫瘤中的生物學(xué)作用。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指通過雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)在特定酶參與下，特異性地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象。它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有同源序列的雙鏈RNA，誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。是研究基因功能的重要技術(shù)方法［10］。siRNA介導(dǎo)細(xì)胞目前有瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染二種方式。本研究采用構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體方式，主要是基于TIZN端(95～213aa)的鋅指結(jié)構(gòu)與TRAF-6 N端的環(huán)指結(jié)構(gòu)結(jié)合造成TRAF-6構(gòu)型的改變，從而發(fā)揮生物作用，TIZ可能是通過調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮作用而并非直接作用［3］。而穩(wěn)定介導(dǎo)并沉黙TIZ基因后，有助于有充分的時(shí)間空間觀察TIZ基因敲除后對其所調(diào)節(jié)上下游基因的影響。

在siRNA實(shí)驗(yàn)中有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，一是靶細(xì)胞的選擇，它必須是被敲除目的基因的表達(dá)陽性者，本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法檢測不同卵巢癌細(xì)胞株TIZ基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示卵巢癌細(xì)胞HO8910細(xì)胞無TIZ基因 mRNA表達(dá)，而 SKOV3、SKOV3順鉑耐藥、SKOV3卡鉑耐藥、A2780和A2780卡鉑耐藥細(xì)胞等均有TIZ基因mRNA表達(dá)。因此選擇SKOV3作為TIZ基因敲除的靶細(xì)胞對象。二是選擇有效的siRNA片段，由于siRNA片段設(shè)計(jì)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找AA或者NA的二連序列，并記下其3’端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。同時(shí)于不同序列siRNA片段的結(jié)合復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA，從而影響siRNA效果［11］，因此選擇有效的siRNA片段非常關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)573號siRNA片段可以有效抑制TIZ基因mRNA的表達(dá)，573號干擾片段細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)后下調(diào)細(xì)胞TIZ mRNA表達(dá)相對拷貝數(shù)最明顯，與陽性對照組和陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，對TIZ基因沉默率達(dá)60%，進(jìn)而選擇573號siRNA構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573干擾載體，為進(jìn)一步研究TIZ基因的功能及探討以TIZ基因?yàn)榘悬c(diǎn)的基因治療奠定了基礎(chǔ)。

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