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(1北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100191;2北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

CDC25磷酸酶能夠使蛋白質(zhì)底物上磷酸化的絲/蘇氨酸殘基或酪氨酸殘基去磷酸化，參與細胞周期調(diào)節(jié)并調(diào)控細胞應(yīng)對DNA損傷［1］。近年來研究顯示，CDC25A/B同時在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等［2］多種高發(fā)的人類腫瘤中高表達，CDC25A還在肝細胞癌［3］高表達，CDC25B 在前列腺癌［4］高表達，因此認為它們可能參與了人類腫瘤的發(fā)生和演進。目前，篩選以蛋白質(zhì)磷酸酶CDC25A/B為靶標(biāo)的新型小分子抗腫瘤藥物，已成為當(dāng)今腫瘤藥物研發(fā)的熱點［2，5］。2008年10月～2010年 10月進行本研究，通過克隆和表達人CDC25A/B融合蛋白，探討構(gòu)建高通量靶向抗癌藥篩選體系的途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 pGEX-4T-1載體、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I、T4 DNA連接酶購自Takara公司;DNA片段快速回收試劑盒、谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B購自北京鼎國公司;DNA序列分析由北京三博遠志公司完成;還原型谷胱甘肽(GSH)購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司;對硝基苯基磷酸鹽(pNPP)購自Amresco公司;維生素K3(VK3)購自Johnson Matthey公司。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)，針對人CDC25A(283～523 aa)催化結(jié)構(gòu)域序列和CDC25B(275～566 aa)催化結(jié)構(gòu)域序列分別設(shè)計兩對引物，經(jīng)巢式PCR擴增出目的基因。第1輪 PCR:CDC25A引物:上游:5'-GTTTGACTCCCCTTCCCTGTGTAG-3'，下 游:5'-TTGGGCTGCTGCTGGCTGGTCCTG-3';CDC25B引物:上游:5'-GGGCCAGCCGCAGGGAAG-3'，下 游:5'-TGGGGCAGACAGGCAGGACACC-3'。第2輪PCR:CDC25A引物:上游:5'-CGGGATCCTCTCCACCTGGAAGTACAAAG-3'，下游:5'-CCGCTCGAGGAGCTTCTTCAGACGACTGAT-3';CDC25B引物:上游:5'-CGGGATCCCAGCGGCTCTTCCGCTCTCCG-3'，下 游:5'-CCGCTCGAGCTGGTCCTGCAGCCGGCTACA-3'。在第2輪PCR上游引物的5'端和下游引物的5'端分別引入BamH I和Xho I限制性酶切位點。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR擴增人 CDC25A/B基因 以本實驗室保存的人HEK293細胞cDNA為模板，加入合成的上下游引物經(jīng)RT-PCR擴增出CDC25A。以本實驗室保存的HeLa細胞cDNA為模板，加入合成的上下游引物經(jīng)RT-PCR擴增出CDC25B。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果，并切膠回收，同時對DNA定量。

1.2.2 pGEX-4T-1-CDC25A/B 重組質(zhì)粒的構(gòu)建將攜帶有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的pGEX-4T-1載體及純化的CDC25A和CDC25B PCR產(chǎn)物分別用BamH I和Xho I進行雙酶切，T4 DNA連接酶于4℃連接過夜，將連接產(chǎn)物 pGEX-4T-1-CDC25A/B重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，以氨芐青霉素抗性初篩，挑取單克隆提取質(zhì)粒，進行BamH I和Xho I雙酶切鑒定。

1.2.3 重組GST-CDC25A/B融合蛋白的誘導(dǎo)表達將測序正確的 pGEX-4T-1-CDC25A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，從37℃培養(yǎng)過夜的LB平板上挑取菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基5 ml中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜;次日按1∶250的比例接種于1 L新鮮培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.5～0.6時，取出少量以備分析;加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，25℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，同樣取出少量以備分析;離心收集菌體。GST-CDC25B的誘導(dǎo)表達過程同上。

1.2.4 重組GST-CDC25A/B融合蛋白的純化 在每升LB培養(yǎng)基收集的菌體中加入30 ml裂解液，冰上裂解30 min后4℃、17 300 g離心15 min，收集上清;將上清緩慢通過預(yù)先用PBS平衡的Glutathione Sepharose 4B，用流洗液洗柱，洗脫目的蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE檢測融合蛋白，合并目的蛋白洗脫峰，加5%甘油－80℃冰箱保存。GST-CDC25B的純化過程同上。

1.2.5 重組GST-CDC25A/B融合蛋白的活性測定以pNPP作為底物，于96孔板中每孔加入磷酸酶活性測定緩沖液和梯度劑量的純化后的GSTCDC25A融合蛋白共135 μl，再加入100 mmol/L p-NPP 15 μl/孔。于37℃溫箱孵育2 h后，每孔加入4 mol/L NaOH 12.5 μl終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測量波長405 nm的吸光度(A)值。以僅加入活性測定緩沖液和pNPP的空白孔調(diào)零。GST-CDC25B活性測定過程同上。

1.2.6 以CDC25A/B為靶標(biāo)的磷酸酶抑制劑驗證性篩選 根據(jù)上述測定融合蛋白活性的方法，于96孔板中加入磷酸酶活性測定緩沖液、GST-CDC25A融合蛋白(3.5 μg/孔)和一系列濃度梯度稀釋的VK3共135 μl，先于4 ℃孵育30 min，再向每孔加入100 mmol/L pNPP 15 μl，37 ℃溫箱孵育2 h 后，每孔加入4 mmol/L NaOH 12.5 μl終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測量波長405 nm的A值。VK3對GST-CDC25B的活性抑制實驗步驟同上(用量為1 μg/孔)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒的鑒定 見圖1。

2.2 重組GST-CDC25A/B融合蛋白的表達及純化見圖2。

圖1 CDC25A/B基因PCR產(chǎn)物及pGEX-4T-1-CDC25A/B重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

圖2 SDS-PAGE分析GST-CDC25A/B融合蛋白的表達及純化結(jié)果

2.3 重組GST-CDC25A/B融合蛋白活性測定結(jié)果底物水解活性與融合蛋白之間存在劑量依賴性(GST-CDC25A/B融合蛋白與底物水解活性間的線性相關(guān)系數(shù)r均＞0.99)，且GST-CDC25B融合蛋白的活性高于GST-CDC25A，前者約是后者的6倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 驗證性抑制劑篩選顯示VK3對CDC25A/B的作用 以pNPP為底物，測得VK3對重組GSTCDC25A/B融合蛋白活性均具有劑量依賴性抑制作用。VK3對CDC25A/B的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為 0.8 和 1.8 μg/ml，表明 VK3對 CDC25A 有更強的抑制作用，即對CDC25A的抑制作用是CDC25B的2.3 倍。

3 討論

細胞周期紊亂是腫瘤細胞的標(biāo)志性特征之一。最近幾年有關(guān)CDC25在人類腫瘤細胞中過度表達的報道屢見不鮮，尤其是CDC25A/B亞型的表達與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。通常高表達CDC25A/B亞型的腫瘤惡性程度較高且患者預(yù)后較差，術(shù)后5年生存率較低。腫瘤組織中高表達的CDC25磷酸酶可使底物CDK2或CDK1分子上抑制性磷酸化位點(Thr14和Tyr15)去磷酸化，促進腫瘤細胞周期G1/S和G2/M期的行進，促進腫瘤細胞生長。因此，研制針對CDC25A/B磷酸酶的高選擇性靶向抗癌藥物，有可能抑制CDC25A/B的上述作用，使細胞周期阻斷，甚至誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，對于高表達CDC25磷酸酶腫瘤的治療及完善腫瘤綜合治療方案具有重要價值［6］。

雖然20世紀末人們已報道了CDC25A/B磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，但磷酸酶與其小分子抑制物相互作用的規(guī)律尚未被人們完全認識［7］，使得CDC25磷酸酶靶向抗癌藥的研制長期以來進展緩慢。迄今為數(shù)不多的高效選擇性CDC25磷酸酶抑制劑都是以pNPP、3-奧美拉唑—熒光素—單磷酸鹽(OMFP)等作為底物經(jīng)體外篩選獲得的［8］。本研究將CDC25A/B催化區(qū)結(jié)構(gòu)域cDNA序列克隆到攜帶GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1中，通過IPTG誘導(dǎo)，分別表達了GST-CDC25A/B融合蛋白，并在96孔板中以pNPP為底物測定了純化后融合蛋白的活性，發(fā)現(xiàn)融合蛋白GST-CDC25A/B在微克級別均展示出良好的底物水解活性，表明融合蛋白對于底物pNPP具有較高的靈敏度。以pNPP為底物可利用常規(guī)酶標(biāo)儀進行高通量檢測，具有簡便易行的優(yōu)點。

VK3作為CDC25磷酸酶的小分子抑制劑展示出廣譜的抗腫瘤活性。Wu等［9］的研究顯示，VK3能夠與CDC25A的催化結(jié)構(gòu)域共價結(jié)合并抑制其磷酸酶活性，阻止底物CDK1上磷酸化的Thr14和Tyr15水解，誘導(dǎo)細胞周期阻滯并導(dǎo)致細胞凋亡。然而，VK3對 CDC25B是否也有抑制作用、與CDC25A相比VK3對何種CDC25的抑制作用更強等問題，目前尚未見文獻報道。本文研究證實，VK3能夠抑制CDC25A/B的磷酸酶活性，并發(fā)現(xiàn)在相同實驗條件下VK3對CDC25B的抑制作用較弱，其IC50值是 CDC25A的2.3倍。該發(fā)現(xiàn)為深入探討VK3對癌細胞周期阻斷的分子機制提供了線索。

綜上所述，本研究表達和純化了具有磷酸酶活性的GST-CDC25A/B融合蛋白，并以pNPP為底物建立了基于96孔板的靶酶抑制劑高通量篩選體系。目前，正在應(yīng)用該篩選體系研發(fā)以CDC25A/B為靶標(biāo)的VK3衍生物類新型靶向抗癌藥。

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