楊俊杰，劉志強(qiáng)，王海濱，劉劍鋒，陳韻岱

干細(xì)胞治療缺血性心臟病正引起基礎(chǔ)研究者和臨床工作者的極大興趣。脂肪來源干細(xì)胞因其取材方便、易于擴(kuò)增、多能性好、免疫原性弱等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為研究熱點(diǎn)［1，2］。作為脂肪組織的一種重要類型，棕色脂肪在人體內(nèi)的活性和作用正受到極大關(guān)注。棕色脂肪組織有別于常見的白色脂肪組織，可特異性表達(dá)解偶聯(lián)蛋白(UCP-1)通過解除氧化呼吸鏈中氫離子梯度而抑制能量物質(zhì)三磷酸腺苷的產(chǎn)生，并最終將生物反應(yīng)以熱能的形式釋放出來［3］。以往認(rèn)為棕色脂肪只存在于小型哺乳動(dòng)物和嬰幼兒體內(nèi)，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)成人體內(nèi)仍存在一定數(shù)量但活性較低的棕色脂肪［4］。新近的研究還發(fā)現(xiàn)乳鼠的棕色脂肪組織內(nèi)含有一定數(shù)量(0.2% ～4%)的心臟前體細(xì)胞(又稱心臟干細(xì)胞)［5］，具有體外自發(fā)分化和誘導(dǎo)分化能力［6］，較其他干細(xì)胞更具運(yùn)用前景［7］。本研究利用寒冷低溫條件飼養(yǎng)大鼠，檢測(cè)其肩胛部棕色脂肪組織活性變化;采用已經(jīng)報(bào)道過細(xì)胞提取的方法［8］，研究寒冷刺激對(duì)于肩胛部棕色脂肪中心臟干細(xì)胞含量的影響。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)分組:2011-03-01從軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買SD大鼠12只(80～120g)。隨機(jī)分為2組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組在寒冷環(huán)境下(4℃)飼養(yǎng)，對(duì)照組在常溫條件(24℃)飼養(yǎng)，均飼養(yǎng)28天。兩組飲水量和喂食等處理均相同。

棕色脂肪來源細(xì)胞的提取與培養(yǎng):斷頸處死各組大鼠，隨后取盡肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織稱重，一部分進(jìn)行棕色脂肪組織的驗(yàn)證，另一部分運(yùn)用酶消化法分離培養(yǎng)獲得棕色脂肪來源細(xì)胞。從SD大鼠肩胛部分離脂肪組織1 g進(jìn)行細(xì)胞提取。分離的脂肪組織以無菌液大量沖洗。隨后，用含0.1% Ⅰ型膠原酶、0.1%中性金屬蛋白水解酶和0.05%胰酶的無血清培養(yǎng)基在37℃下消化45分鐘，后使用含10%的無血清培養(yǎng)基終止消化，并通過75 μm的濾網(wǎng)過濾、紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。最終將細(xì)胞進(jìn)行離心和重懸，并接種至含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1天后換液棄除未貼壁細(xì)胞，每隔兩天觀察并換液。

棕色脂肪組織形態(tài)及活性:經(jīng)冰凍切片包埋劑固定的大鼠肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織標(biāo)本經(jīng)切片后，使用蘇木素伊紅染色法染色并觀察棕色脂肪組織形態(tài)。組織蛋白經(jīng)處理后使用western blot方法檢測(cè)UCP-1表達(dá)情況。

細(xì)胞表面標(biāo)記物的檢測(cè):提取得到的棕色脂肪來源細(xì)胞經(jīng)過紅細(xì)胞裂解液處理后，使用表面標(biāo)記物CD29、CD34、CD45、CD90 和 CD133 抗體，按照廠家說明加入以上抗體，使用流式細(xì)胞儀鑒定。

自發(fā)分化心肌樣細(xì)胞的檢測(cè):以1×105/cm2、5×104/cm2、1×104/cm2、5×103/cm2、1×103/cm2的細(xì)胞密度接種。培養(yǎng)4周后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。免疫熒光檢測(cè):取出預(yù)先置入的細(xì)胞爬片固定。經(jīng)0.1%TrionX-100打孔，分別在肌鈣蛋白-T(cTnT)抗體(1∶200)和α-橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白(α-SCA)抗體(1∶200)中4℃孵育過夜。隨后以二抗標(biāo)記，并染核，在熒光倒置顯微鏡下觀察物鏡40×視野下綠色熒光范圍中的細(xì)胞核數(shù)量與總核數(shù)量的百分比。

核糖核酸(RNA)提取和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)分析:分化后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在倒置位差顯微鏡下選取狹長(zhǎng)成簇的細(xì)胞進(jìn)行消化和提取。Trizol法提取各自總RNA，以大鼠心肌組織作為陽性對(duì)照。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN)方法步驟逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，最后進(jìn)行凝膠成像。在多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增中使用的引物包括:cTnI(5’-CTCGGAGTATCAGGAAGAGCACA;3’-TAAACTTGCCACGCAGGTCATAG，216 bp)，GATA-4(5’-CTGTCATCTCACTATGGGCA;3’-CCAAGTCCGAGCAGGAATT，257bp)，Nkx2.5(5’-CAGTGGAGCTGGACAAAGCC;3’-TAGCGACGGTTCTGGAACCA，216 bp)，MEF-2C(5’-AGCAAGAATACGATGCCATC;3’-GAAGGGGTGGTGGTACGGTC，347 bp)，β-Actin(5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC;3’-AGGAGCCAGGCAGTAATC，353 bp)。

反應(yīng)條件為:各反應(yīng)體系先94℃預(yù)變性3 min，接著35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min)，最后延伸5 min至22℃。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 13統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 寒冷刺激后的棕色脂肪形態(tài)與活性表達(dá)

寒冷刺激后，肩胛部棕色脂肪組織的形態(tài)特征較對(duì)照組發(fā)生相應(yīng)變化，具體表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞線粒體彌漫增多，脂肪滴變小，脂肪組織毛細(xì)血管基質(zhì)增生。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組棕色脂肪組織中特異性功能蛋白UCP-1的表達(dá)量明顯增加。(圖1)

2.2 提取的棕色脂肪來源細(xì)胞中的表面標(biāo)志物表達(dá)

細(xì)胞流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組表面標(biāo)記物CD29、CD133和CD29/CD133表達(dá)分別為(22.93±1.88)%、(15.12±1.47)% 和(9.13±1.23)%，均明顯高于對(duì)照組(16.31±1.52)%、(7.83±0.90)%和(4.22±0.62)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而間充質(zhì)細(xì)胞特異性表面抗原以及造血干細(xì)胞表面特異性抗原的表達(dá)，在兩組中差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 棕色脂肪形態(tài)與活性表達(dá)。1A:常溫飼養(yǎng)后提取的棕色脂肪組織形態(tài)(HE染色)。1B:低溫飼養(yǎng)后提取的棕色脂肪組織形態(tài)(HE染色)。1C:特異性蛋白UCP-1在兩組棕色脂肪組織中的表達(dá) HE:蘇木素伊紅 UCP-1:解偶聯(lián)蛋白-1 β-actin:β-肌動(dòng)蛋白

2.3 自發(fā)分化后的心肌樣標(biāo)志物表達(dá)

定期顯微鏡下觀察，棕色脂肪來源細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)逐漸出現(xiàn)心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和功能變化:細(xì)胞在1周時(shí)多數(shù)細(xì)胞貼壁鋪展生長(zhǎng)，細(xì)胞分化數(shù)量較少，但有一定數(shù)量圓狀成簇樣細(xì)胞存在;2～4周后，狹長(zhǎng)的細(xì)胞明顯增多，并表現(xiàn)為自發(fā)搏動(dòng)的狀態(tài)。進(jìn)一步免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該狹長(zhǎng)型、具有自發(fā)搏動(dòng)能力的細(xì)胞簇，可表達(dá)心肌樣特異性標(biāo)志物cTnT和α-SCA。(圖2)

圖2 自發(fā)分化后的心肌樣標(biāo)志物表達(dá)。2A:光鏡下細(xì)胞形態(tài)(×10)。2B:光鏡下細(xì)胞形態(tài)(×20)。2C:表達(dá)肌鈣蛋白-T。2D:表達(dá)α-橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白

不同接種密度下棕色脂肪來源細(xì)胞自發(fā)分化cTnT陽性細(xì)胞的比例:實(shí)驗(yàn)組的自發(fā)分化cTnT陽性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組棕色脂肪來源細(xì)胞自發(fā)分化cTnT陽性細(xì)胞比例最高為(27.3±2.8)%，而對(duì)照組最高只有(4.1±0.7)%。(表1)

表1 不同接種密度下兩組棕色脂肪來源細(xì)胞自發(fā)分化肌鈣蛋白-T陽性細(xì)胞的比例(x±s)

2.4 心臟特異因子的表達(dá)

逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞特異因子(肌鈣蛋白I、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2C)和轉(zhuǎn)錄因子(轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白-4、同源框蛋白Nkx2.5轉(zhuǎn)錄因子)能夠在棕色脂肪來源細(xì)胞自發(fā)分化后的類心肌細(xì)胞中檢測(cè)出，但是較正常心肌組織表達(dá)量相比仍較為微弱。圖3

圖3 棕色脂肪來源細(xì)胞自發(fā)分化后的心臟特異因子和轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)分析。1:棕色脂肪來源的類心肌細(xì)胞;2:大鼠心肌細(xì)胞(陽性對(duì)照);3:陰性對(duì)照。n=6。cTnI:肌鈣蛋白-I;MEF-2C:肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2C;GATA-4:轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白-4;Nkx2.5:同源框蛋白Nkx2.5轉(zhuǎn)錄因子;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白

3 討論

發(fā)現(xiàn)寒冷刺激后大鼠肩胛部棕色脂肪來源細(xì)胞的體外心肌自發(fā)分化現(xiàn)象顯著增加。同時(shí)，其肩胛部棕色脂肪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的顯著變化，特異性蛋白明顯過表達(dá)，提示寒冷刺激下棕色脂肪組織活性顯著增強(qiáng)可能與上述現(xiàn)象有關(guān)。

相關(guān)文獻(xiàn)指出，棕色脂肪來源細(xì)胞中的CD29陽性和CD133陽性的細(xì)胞，具有高度自發(fā)分化為心肌分化的能力［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，寒冷刺激下棕色脂肪組織來源細(xì)胞表面標(biāo)志物中CD29和CD133所占比例明顯升高，而且CD133表達(dá)陽性的細(xì)胞中有更多的表達(dá)CD29。雖然我們沒有做其它心臟干細(xì)胞特異抗原的檢測(cè)，但是在后續(xù)的體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周無分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，寒冷刺激組中的心肌分化效率明顯增高。運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)也鑒定了狹長(zhǎng)細(xì)胞中的心肌特異性基因表達(dá)情況。同時(shí)細(xì)胞接種密度也影響著心肌自發(fā)分化的效率:通過設(shè)立不同接種細(xì)胞數(shù)目的分組，發(fā)現(xiàn)寒冷刺激組比常溫飼養(yǎng)組中的心肌特異性標(biāo)記肌鈣蛋白表達(dá)效率明顯增高，這些都說明寒冷刺激組的棕色脂肪來源細(xì)胞體外心肌自發(fā)分化現(xiàn)象更為明顯，因而可以推測(cè)該組中的棕色脂肪中含有更多的心臟干細(xì)胞。盡管如此，完整的心肌細(xì)胞還需要成熟的膜電位和縫隙連接證實(shí)，這也是本實(shí)驗(yàn)的不足之處。

從組織起源角度，脂肪組織和肌纖維組織都來源于胚胎中胚層。研究發(fā)現(xiàn)，白色脂肪和棕色脂肪的起源不盡相同，相比之下，棕色脂肪細(xì)胞與肌細(xì)胞更傾向于具有相同的前體干細(xì)胞來源。因此在棕色脂肪組織中發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞的前體細(xì)胞，甚至心臟干細(xì)胞及其自發(fā)分化的現(xiàn)象，確實(shí)具有一定的理論和前期研究基礎(chǔ)。雖然也有報(bào)道指出，白色脂肪組織中提取的細(xì)胞也具有體外分化心肌的能力，但效率非常低［10］。

在其他混雜因素被嚴(yán)格控制的前提下，以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明寒冷刺激下，棕色脂肪活性與其中心臟干細(xì)胞含量有一定聯(lián)系。近年來，多項(xiàng)人體影像學(xué)研究顯示，成人體內(nèi)仍然存在棕色脂肪，只是在寒冷、饑餓等狀態(tài)下，棕色脂肪組織的功能進(jìn)一步活化以至可以被PET等技術(shù)檢測(cè)［11］。人體心臟內(nèi)甚至也含有存在活性的棕色脂肪組織，在寒冷誘導(dǎo)下同樣可以被檢測(cè)到［12］，更說明心臟修復(fù)與棕色脂肪組織之間存在一定關(guān)聯(lián)。我們有理由推測(cè)，棕色脂肪組織中的心臟干細(xì)胞，極有可能參與心臟的修復(fù)，并在寒冷等因素影響下，心臟干細(xì)胞的動(dòng)員或增殖能力加強(qiáng)，使得體內(nèi)心臟干細(xì)胞活性或絕對(duì)數(shù)量相應(yīng)增加，可以更有效的修復(fù)受損心肌，改善心臟功能，降低心臟病預(yù)后。本研究對(duì)于拓展心臟干細(xì)胞的理念以及深入研究心臟干細(xì)胞治療都具有重大意義。

另一方面，棕色脂肪在成人體內(nèi)確實(shí)較少，但是當(dāng)棕色脂肪的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增技術(shù)不再成為難題的時(shí)候，棕色脂肪組織或許可以在心臟病干細(xì)胞治療領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用。如何進(jìn)一步純化并分選棕色脂肪組織中的心臟干細(xì)胞，是下一步研究需要弄清的問題。同時(shí)，棕色脂肪在寒冷中的活性變化由諸多因素參與介導(dǎo)［13，14］，心臟干細(xì)胞含量增多的具體機(jī)制與哪些因素有關(guān)還不得而知［15，16］，也將成為進(jìn)一步的研究方向。

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