劉 濤，李占林，王 宇，田 黎，裴月湖，華會明

(1.中國醫(yī)科大學藥學院，遼寧 沈陽 110001；2.沈陽藥科大學 創(chuàng)新藥物研究與設(shè)計教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110016；3.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；4.青島科技大學，山東 青島 266042)

近年來，海洋微生物次級代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究日趨活躍，其中海洋真菌更是該領(lǐng)域研究的熱點。海洋獨特的生存環(huán)境使海洋真菌的次級代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)類型及生物活性等方面都呈現(xiàn)出與陸生真菌不同的特點和多樣性，其在抗腫瘤、抗微生物等方面巨大的開發(fā)與應(yīng)用潛質(zhì)，引起了人們的極大關(guān)注[1]。

作者在此對海洋來源真菌Fusariumsp.菌絲體的丙酮提取物進行了化學成分分離，通過波譜及理化性質(zhì)分析確定了這些化合物的結(jié)構(gòu)。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

鐮孢霉屬真菌Fusariumsp.于2007年4月分離自南海潮間帶紅樹植物正紅樹(Rhizophoraapiculata)根際泥，由國家海洋局第一海洋研究所、青島科技大學田黎教授鑒定。菌株編號：HTTM-Z07006，存放于科技部資助的國家海洋局第一海洋研究所藥用海洋微生物菌種資源庫。

實驗所用試劑為分析純或色譜純。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯浸汁200 mL，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，葡萄糖17 g，NaCl 15 g，MgCl2·6H2O 1 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)ePO40.01 g，水1000 mL。

開放ODS柱色譜填料(100 μm)，日本YMC公司；Sephadex LH-20，GE Healthcare公司；柱色譜硅膠(200～300目)、薄層色譜硅膠，青島海洋化工廠；Bruker ARX-300、AV-600型核磁共振儀；L2130型HPLC(檢測器為HITACHI L 2400 型)，日本HITACHI公司；YMC-Pack ODS-AM(10 mm×250 mm)。

1.2 方法

取菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，24 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 d，發(fā)酵量60 L。

發(fā)酵液經(jīng)多層紗布過濾，分離得到濾液和菌絲體。菌絲體(濕重1906.5 g)經(jīng)反復(fù)冷凍-融化處理后，用4 BV丙酮超聲提取3次，每次提取1 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏81.5 g。菌絲體丙酮提取物經(jīng)硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇[(100∶0)～(0∶100)]梯度洗脫，得到282個流分(500 mL/流分)。

第33～55流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第20～31亞流分經(jīng)Sephadex LH-20柱進一步純化，得到化合物1(2 mg)。

第73～84流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用甲醇洗脫，第12亞流分經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物6(5 mg)；第26～27亞流分合并得到化合物2(2 mg)。

第51～57流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第20～22亞流分合并，用甲醇-水(30%～100%)梯度洗脫及Sephadex LH-20柱色譜，得到化合物7(2 mg)和9(10 mg)。

第124～135流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第11亞流分得到化合物3(4 mg)；第16～19亞流分合并，經(jīng)純化得到化合物8(5 mg)。

第136～149流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第14、15亞流分得到化合物10(30 mg)。

第180～188流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第19～25亞流分得到化合物4(6 mg)。

第195～210流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第26～43亞流分經(jīng)開放ODS色譜柱，用甲醇-水(5%，10%)洗脫，得到化合物5(8 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)表征

化合物1：桔黃色針晶(甲醇)，UV 365 nm下有桔紅色熒光，Borntr?ger′s反應(yīng)陽性。IR(KBr)，ν,cm-1：3424(OH)，1628(締合C=O)；1HNMR(600 MHz，DMSO-d6),δ,ppm:12.12(1H，s，5-OH)，12.07(1H，s，1-OH)，11.40(1H，br s，3-OH)，7.53(1H，d，J=1.2 Hz，H-8)，7.20(1H，d，J=1.2 Hz，H-6)，7.14(1H，d，J=2.1 Hz，H-4)，6.60(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，2.43(3H，s，7-CH3)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻[2]，鑒定該化合物為1，3，5-三羥基-7-甲基蒽醌(1，3，5-Trihydroxyl-7-methylanthraquinone)。

化合物2：桔黃色無定形粉末，UV 365 nm下有桔紅色熒光，Borntr?ger′s反應(yīng)陽性。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm：12.16(2H，br s，1，8-OH)，7.66(1H，br s，H-4)，7.26(1H，br s，H-5)，7.12(1H，br s，H-2)，6.56(1H，br s，H-7)，5.56(1H，br s，CH2OH)，4.61(2H，d，J=4.7 Hz，CH2OH)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻[3]，鑒定該化合物為6-羥基蘆薈大黃素(Citreorosein)。

化合物3：白色無定形粉末，10% 硫酸乙醇顯紫色，Molish反應(yīng)陽性。1HNMR(600 MHz，C5D5N)，δ,ppm:5.33(1H，br s，H-6)，5.23(1H，q，J=6.6 Hz，H-28)，5.07(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，4.58(1H，dd，J=12.0 Hz，2.4 Hz，H-6′a)，4.43(1H，dd，J=12.0 Hz，5.4 Hz，H-6′b)，4.32(1H，dd，J=9.0 Hz，8.0 Hz，H-4′)，4.30(1H，dd，J=9.0 Hz，8.0 Hz，H-3′)，4.08(1H，t，J=7.8 Hz，H-2′)，4.01(1H，m，H-3)，3.95(1H，m，H-5′)，1.02(3H，d，J=7.2 Hz，H-21)，0.89(3H，s，H-19)。13CNMR(150 MHz，C5D5N),δ,ppm:145.9(C-24)，140.9(C-5)，121.9(C-6)，117.1(C-28)，102.6(C-1′)，78.7(C-3′)，78.5(C-5′)，78.1(C-3)，75.4(C-2′)，71.8(C-4′)，62.9(C-6′)，56.8(C-14)，56.2(C-17)，50.4(C-9)，42.5(C-13)，40.0(C-4)，39.4(C-12)，37.5(C-1)，37.0(C-10)，36.5(C-20)，36.4(C-22)，32.2(C-8)，32.1(C-7)，30.3(C-2)，28.9(C-25)，28.5(C-23)，28.4(C-16)，24.5(C-15)，21.3(C-27)，21.2(C-26)，21.2(C-11)，19.5(C-19)，19.0(C-21)，13.0(C-29)，12.0(C-18)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻[4，5]，鑒定該化合物為 3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-豆甾-5，24(28)Z-二烯(3-O-β-D-Glucopyranosyl-stigmasta-5，24(28)Z-diene)。

化合物4：無色針晶(甲醇)，UV 254 nm下有明顯暗斑。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm：11.31(1H，s，NH)，7.88(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，5.77(1H，d，J=5.4 Hz，H-1′)，5.62(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，5.37(1H，d，J=5.7 Hz，OH)，5.09(2H，m，OH)，4.01(1H，m，H-3′)，3.94(1H，m，H-2′)，3.82(1H，m，H-4′)，3.60(1H，m，H-5′a)，3.53(1H，m，H-5′b)。與尿嘧啶核苷對照品共薄層，多種溶劑系統(tǒng)下Rf值一致，并結(jié)合文獻[6]，鑒定該化合物為尿嘧啶核苷(Uridine)。

化合物5：白色無定形粉末，UV 254 nm下有明顯暗斑。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm:12.42(1H，br s，NH)，8.35(1H，s，H-2)，8.08(1H，br s，H-8)，5.86(1H，d，J=6.0 Hz，H-1′)，4.48(1H，m，H-3′)，4.12(1H，m，H-2′)，3.93(1H，m，H-4′)，3.64(1H，m，H-5′a)，3.55(1H，m，H-5′b)。13CNMR(75 MHz，DMSO-d6)，δ,ppm:61.4(C-5′)，70.4(C-3′)，74.2(C-2′)，85.7(C-4′)，87.5(C-1′)，124.5(C-5)，138.8(C-2)，146.0(C-8)，148.3(C-4)，156.6(C-6)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻[7]，鑒定該化合物為次黃嘌呤核苷(Inosine)。

化合物6：無色針晶(甲醇)，1HNMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm:8.09(1H，s，NH)，4.12(1H，m，H-6)，4.00(1H，d，J=16.8 Hz，H-3a)，3.50(1H，dd，J=4.8 Hz，16.8 Hz，H-3b)，3.37(2H，m，H-9)，2.12(1H，m，H-7a)，1.82(3H，m，H-7b，H-8)。13CNMR(150 MHz，DMSO-d6)，δ,ppm:169.3(C-2)，163.9(C-5)，58.1(C-6)，46.0(C-3)，44.7(C-9)，27.9(C-7)，22.1(C-8)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻[8]，鑒定該化合物為吡咯并哌嗪-2，5-二酮(Pyrrolopiperazine-2，5-dione)。

化合物7：無色針晶(甲醇)，1HNMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm：7.95(1H，s，NH)，4.12(1H，m，H-6)，3.92(1H，br s，H-3)，3.34(2H，m，H-9)，2.34(1H，m，H-10)，2.13(1H，m，H-7a)，1.82(3H，m，H-7b，H-8)，1.01(3H，d，J=7.2 Hz，H-11 or H-12)，0.85(3H，d，J=6.6 Hz，H-12 or H-11)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻[9]，鑒定該化合物為3-異丙基吡咯并哌嗪-2，5-二酮(3-Isopropylpyrrolopiperazine-2，5-dione)。

化合物8:白色無定形粉末，UV 254 nm下有明顯暗斑。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm：10.94(1H，s，NH)，10.75(1H，s，NH)，7.37(1H，d，J=7.7 Hz，H-6)，5.44(1H，d，J=7.7 Hz，H-5)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻[10]，并與尿嘧啶對照品共薄層，Rf值一致，鑒定該化合物為尿嘧啶(Uracil)。

化合物10：無色針晶(甲醇)，1HNMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm:4.41(2H，d，J=5.6 Hz，OH)，4.33(2H，d，J=5.7 Hz，OH)，4.13(2H，d，J=7.1 Hz，OH)，3.59(2H，m，H-1a,H-6a)，3.52(2H，t，J=7.7 Hz，H-1b,H-6b)，3.43(2H，m，H-2,H-5)，3.36(2H，m，H-3,H-4)。13CNMR(150 MHz，DMSO-d6),δ,ppm:63.7(C-1,C-6)，69.6(C-3,C-4)，71.2(C-2,C-5)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻[13]，鑒定該化合物為甘露醇(Mannitol)。

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)式

根據(jù)2.1分析結(jié)果，確定化合物1～10的結(jié)構(gòu)式如下：

3 結(jié)論

從海洋來源真菌Fusariumsp.的菌絲體中分離得到10個化合物，通過波譜和理化性質(zhì)分析，分別鑒定為1，3，5-三羥基-7-甲基蒽醌(1)、6-羥基蘆薈大黃素(2)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-豆甾-5，24(28)Z-二烯(3)、尿嘧啶核苷(4)、次黃嘌呤核苷(5)、吡咯并哌嗪-2，5-二酮(6)、3-異丙基吡咯并哌嗪-2，5-二酮(7)、尿嘧啶(8)、10S-羥基十八碳酸(9)、甘露醇(10)。其中化合物1、3和9均為首次從該屬真菌中分離得到。

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