齊 霽 ，鄒小龍

1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100029；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院普外科，黑龍江 哈爾濱 150081

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多基因相互作用的結(jié)果。傳統(tǒng)基因治療技術(shù)一般是在基因水平特異性地誘導(dǎo)單個(gè)癌基因失活，即基因治療只通過對(duì)某一個(gè)癌基因進(jìn)行抑制從而起到治療作用，但是對(duì)于多基因致病的腫瘤來說，僅對(duì)其中某個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)基因沉默很難達(dá)到預(yù)期的療效。與此同時(shí)，基因治療是指在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)基因發(fā)生沉默，這種治療的生物安全性較差。而技術(shù)日趨成熟的RNA干擾（RNAi）技術(shù)的不斷發(fā)展和完善為解決傳統(tǒng)基因治療的生物安全性問題提供了一種可能。RNAi是一種基因轉(zhuǎn)錄后沉默技術(shù)，這種技術(shù)不僅可以產(chǎn)生類似于基因敲除的效果，又不會(huì)對(duì)目標(biāo)DNA序列產(chǎn)生任何遺傳上的改變。由于RNA干擾序列具有很強(qiáng)的序列特異性，因此在RNA干擾序列設(shè)計(jì)的過程中可以利用同一基因家族中的多個(gè)基因具有同源性很高的一段保守序列這一特性，設(shè)計(jì)出針對(duì)某些序列的特異siRNA分子。而后通過注射設(shè)計(jì)好的siRNA使同源基因產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)，同時(shí)，與傳統(tǒng)的基因治療相比，這種RNAi對(duì)機(jī)體其他的基因產(chǎn)生不良影響較少[1]。RNAi技術(shù)具有較高的穩(wěn)定性和基因沉默的效率，而且將siRNA進(jìn)一步地加以修飾就可以有效地避免核酸酶的降解，使其更穩(wěn)定地發(fā)揮作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)90%以上的基因進(jìn)行沉默。綜上所述，RNAi技術(shù)在腫瘤的病因研究和靶向治療等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此，充分發(fā)揮RNAi技術(shù)的優(yōu)勢(shì)對(duì)于腫瘤研究和治療有著舉足輕重的作用。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，Del1和VEGF分屬于不同類別的促血管形成因子，這兩類因子在結(jié)腸癌的腫瘤血管生成方面具有協(xié)同的促進(jìn)作用[2]。本實(shí)驗(yàn)使用RNAi抑制促血管形成因子基因的表達(dá)，觀察結(jié)腸癌的基因治療效果，從而明確RNAi抑制促血管形成因子的基因治療方式對(duì)結(jié)腸癌治療效果的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

5周齡BALB/C裸鼠（nu/nu）60只，購(gòu)于上海伊萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。Del1和VEGF基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒由武漢晶賽公司構(gòu)建合成。

1.2 ShRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

Del1和VEGF基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒由武漢晶賽公司構(gòu)建合成。四條針對(duì)Del1基因（Genbank HSU7_0312）不同靶點(diǎn)的shRNA篩選設(shè)計(jì)后構(gòu)建于同一個(gè)質(zhì)粒中，四條shRNA的序列為：AATGGAGGTATCTGTTTGC CA（207～227nt）；GTTCAGTGTTGTGGAGGT（286～304nt）;AAGC ATACCGG-GGGATACAT （388～408 nt)；AATGTCATCGACCTCCCATC（1443～1463 nt）。 合成的重組質(zhì)粒記為pshRNADel1。三條針對(duì)VEGF基因（GenBankNM_001033756）不同靶點(diǎn)的shRNA篩選設(shè)計(jì)后構(gòu)建于同一個(gè)質(zhì)粒中，三條shRNA的 序 列 為 AGAAAGATAGAGCAAGACA （1429～1447 nt）；CGCAGAAGTGCTAGCTCG（728～746 nt）；CCTTGCCTGCTGCT CTAC （1064～1082 nt）。合成的重組質(zhì)粒記為 pshRNAVEGF。經(jīng)過BLASTN檢驗(yàn)與其他基因沒有同源性。晶賽公司將4種不同哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子 （hU6、hH1、mU6和h7SK）分別操縱的shRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元，即啟動(dòng)子－shRNA正義鏈－loop環(huán)－shRNA反義鏈－終止信號(hào)構(gòu)建到一個(gè)RNAi載體中，從而實(shí)現(xiàn)了一個(gè)載體編碼4條shRNA的目的。不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄其相應(yīng)的shRNA結(jié)構(gòu)單元，其結(jié)果不僅可以有效地避免意外重組的發(fā)生，而且可以使每條shRNA都能夠有效地完成轉(zhuǎn)錄。

1.3 腫瘤細(xì)胞懸液的制備

待腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)至60%～70%融合時(shí)，棄去腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍后，培養(yǎng)瓶中加入胰酶消化90 s，其后加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，實(shí)現(xiàn)終止消化并用吸管將貼于瓶壁的細(xì)胞吹打下來，而后將混合物一起放置于50 ml的離心管中，將離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)至1000 r/min，離心5 min后，棄上清液，加入20 ml PBS重懸均勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/ml，最后吸入1 ml注射器中備用。

1.4 裸鼠的腫瘤接種

將適應(yīng)SPF環(huán)境的5周齡裸鼠建立結(jié)腸癌動(dòng)物模型。首先在將裸鼠的籠子進(jìn)行消毒處理。固定裸鼠，取其側(cè)腹部為穿刺點(diǎn)，穿刺前用碘伏對(duì)穿刺點(diǎn)進(jìn)行消毒，注射器針頭皮下潛行1 cm左右深進(jìn)行穿刺，緩慢向該部位推注腫瘤細(xì)胞懸液0.1 ml/只。推注完成退針后，再次進(jìn)行消毒。

1.5 裸鼠的分組

接種后觀察裸鼠成瘤情況。并在成瘤后用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積：腫瘤體積 V=π/6×a2×b，π=3.14[注：長(zhǎng)徑（b）、短徑（a）]。待裸鼠接種腫瘤生長(zhǎng)至體積約為100 mm3時(shí)，將60只接種腫瘤的裸鼠隨機(jī)分為5組，分別為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組（Untreated組）、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組（Control組）、轉(zhuǎn)染 pshRNADel1質(zhì)粒組（pshRNA-Del1治療組），轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組 （pshRNA-VEGF治療組）和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組 （pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF治療組）。進(jìn)行基因治療4 d，5組成瘤裸鼠各組隨機(jī)抽4只，檢驗(yàn)其腫瘤中的基因表達(dá)情況。其余的裸鼠治療3周后，將裸鼠處死并進(jìn)行后續(xù)的研究。

1.6 腫瘤的治療及觀察指標(biāo)

1.6.1 腫瘤治療 基因轉(zhuǎn)染液的配制：將濃度為2 mg/ml的純化真核表達(dá)質(zhì)粒 100 μl，用 100 μl FuGENE6稀釋待用。將目的基因 重組 質(zhì) 粒 pshRNA-Del1，pshRNA-VEGF，pshRNADel1+pshRNA-VEGF在FuGENETM6的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，其使用的劑量為每只裸鼠每次200 μg質(zhì)粒與100 μl FuGENETM6混合，直接對(duì)裸鼠瘤體內(nèi)多點(diǎn)行混合注射。Control組裸鼠處理方式是在腫瘤內(nèi)注射200 μg的pshRNAGFP質(zhì)粒；pshRNA-Del1治療組裸鼠的處理方式是在腫瘤內(nèi)注射200 μg的pshRNA-Del1質(zhì)粒；pshRNA-VEGF治療組裸鼠的處理方式是在腫瘤內(nèi)注射200 μg的pshRNA-VEGF質(zhì)粒；pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF治療組裸鼠的處理方式是在腫瘤內(nèi)先注射100 μg的pshRNA-Del1質(zhì)粒，間隔12 h以后，再在腫瘤內(nèi)注射100 μg的pshRNA-VEGF質(zhì)粒。

1.6.2 觀察指標(biāo) ①腫瘤生長(zhǎng)曲線：在腫瘤內(nèi)注射藥物后，每天觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，并且于注射藥物后的第0、3、6、9、12、15、18、21天分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑的大小并記錄，而后計(jì)算腫瘤的體積大小。測(cè)量后將各組裸鼠腫瘤的體積取平均值，繪制皮下腫瘤的生長(zhǎng)曲線圖。②蛋白質(zhì)印跡（Western-blot）：在進(jìn)行了質(zhì)粒注射4 d后，切取腫瘤標(biāo)本，進(jìn)行低溫保存。部分腫瘤組織采用蛋白印跡的方法對(duì)各組Del1蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定中將分組中的未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)照組（untreated組）視為蛋白定量檢測(cè)的對(duì)照組。③免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析：采用免疫組織化學(xué)兩步法，組織切片常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。根據(jù)所應(yīng)用的一抗的要求，對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理（抗原修復(fù)）。滴加小鼠來源的一抗（Ki-67，CD31、VEGF 和 Del1抗體），室溫孵育 60 min，PBS或 TBS沖洗，2 min×3次。滴加兔抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育20 min，PBS或TBS沖洗，2 min×3次。應(yīng)用DAB溶液染色。蒸餾水沖洗10 min、蘇木精復(fù)染、脫水、中性樹脂封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。免疫組織化學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)。其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長(zhǎng)曲線

在腫瘤模型建立后，當(dāng)腫瘤的體積達(dá)到100 mm3時(shí)，隨機(jī)將其分為以下5組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組（Untreated組），轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組（Control組）、轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組（pshRNADel1治療組），轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組（pshRNA-VEGF治療組）和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組（pshRNADel1+pshRNA-VEGF治療組）。如圖1所示：在相同時(shí)間點(diǎn)，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組比較，腫瘤的體積未見明顯差異（P＞0.05）；而轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組分別于與對(duì)照組相比較發(fā)現(xiàn)，其腫瘤的平均體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步的分析顯示，轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組的腫瘤平均體積與轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組的腫瘤平均體積間無明顯的差異（P＞0.05）。與其他各組相比，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組的腫瘤平均體積最小，該治療組與對(duì)照組的腫瘤體積比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組分別與轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組腫瘤體積比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.05）。

圖1 腫瘤生長(zhǎng)曲線圖

圖2 West-blot檢測(cè)蛋白表達(dá)變化圖

2.2 腫瘤基因治療后各治療組Del1蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)

對(duì)腫瘤行基因治療4 d后，從各治療組均隨機(jī)選取4只裸鼠處死，并切除其腫瘤組織待后續(xù)研究。選取轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組作為后續(xù)分析的對(duì)照組。取切除腫瘤部分組織制備組織勻漿，并提取其蛋白，利用West-blot方法檢測(cè)Dell基因和VEGF基因的蛋白表達(dá)量，從而進(jìn)一步分析基因治療前后，各組內(nèi)這2種蛋白的表達(dá)變化。如圖2和圖3所示：與對(duì)照組相比，Del1蛋白的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組明顯呈下降的狀態(tài)，并且Del1蛋白的表達(dá)量在組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與此同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組Del1蛋白的表達(dá)量下降最為明顯，與對(duì)照組相比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。但轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組相比較，Del1蛋白的表達(dá)量未見明顯的差異 （P＞0.05），但這兩組分別與轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.05）。對(duì)于VEDF蛋白的表達(dá)來說，轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組與對(duì)照組中VEGF蛋白的表達(dá)量比較，其明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)Del1蛋白的表達(dá)量也呈現(xiàn)明顯下降的狀態(tài)。轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNAVEGF質(zhì)粒組和對(duì)照組相比，其VEGF蛋白的表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒治療組與轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒治療相比，VEGF蛋白的表達(dá)量無變化（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染 pshRNADel1質(zhì)粒組與對(duì)照組相比，VEGF蛋白的表達(dá)量無變化 （P＞0.05），但Del1蛋白的表達(dá)量明顯地下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 蛋白表達(dá)變化圖

2.3 腫瘤細(xì)胞的Ki-67免疫組化染色結(jié)果

對(duì)于腫瘤組織進(jìn)行RNAi治療4 d后，每組隨機(jī)選取4只裸鼠處死。將每個(gè)切取的腫瘤組織先用多聚甲醛固定，而后用石蠟包埋，然后進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度4 μm。完成上述處理后，用抗Ki-67的抗體進(jìn)行免疫組化染色，標(biāo)記腫瘤組織中增殖的腫瘤細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組作為對(duì)照組，定性的染色結(jié)果如圖4所示：細(xì)胞核染為棕色的為Ki-67染色陽性腫瘤細(xì)胞。筆者發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。從定量的角度研究腫瘤細(xì)胞增殖的變化是否顯著，其結(jié)果如圖5所示。從圖5的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNA-Dell質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組中的腫瘤細(xì)胞增殖百分比明顯降低，并且與對(duì)照組相比，其腫瘤增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。從圖5中筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組腫瘤細(xì)胞的增殖是最低的，并且這組與對(duì)照組相比較，其差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 染色腫瘤細(xì)胞增殖變化圖

圖5 腫瘤增殖率變化圖

2.4 腫瘤的微血管密度

對(duì)腫瘤組織進(jìn)行RNAi治療3周后，將各組的裸鼠處死，測(cè)量其腫瘤的各個(gè)徑線后，用4%的多聚甲醛固定，而后用石蠟包埋并連續(xù)切片，切片厚4 μm。采用抗-CD31單克隆抗體行二步法免疫組化染色檢驗(yàn)?zāi)[瘤的微血管密度變化，其中棕色染色為陽性，在腫瘤組織切片中，隨機(jī)地選取不同的位置來記錄微血管的密度變化。將轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組作為對(duì)照組，如圖6所示：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNAVEGF質(zhì)粒組的腫瘤微血管密度呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。從定量的角度而言，如圖7顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNA-VEGF質(zhì)粒組中其腫瘤的微血管密度減少量約為40%，該組與對(duì)照組腫瘤的微血管密度比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組的腫瘤微血管密度也較對(duì)照組減少了24%，這兩組腫瘤的微血管密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。此外，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pshRNADel1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組較對(duì)照組的腫瘤微血管密度減少了60%，并且這兩組間腫瘤微血管密度比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。與此同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pshRNADel1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒組的腫瘤微血管密度分別與轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒組相比，均呈現(xiàn)下降的狀態(tài)，并且腫瘤微血管密度在組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染 pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF 質(zhì)粒組腫瘤的微血管密度減少最明顯，也說明了pshRNA-Del1質(zhì)粒和pshRNA-VEGF質(zhì)粒在抑制腫瘤微血管生成方面具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。

圖6 腫瘤新生血管切片染色圖

圖7 腫瘤新生血管的密度變化圖

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生是多個(gè)癌基因共同作用的結(jié)果，是多因子、多水平的異常引起的惡性疾病?，F(xiàn)階段對(duì)于癌癥的臨床治療治療，控制血管再生過程是控制惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要手段。血管再生是有多種細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子參與的、在預(yù)存的血管上產(chǎn)生新的毛細(xì)胞血管的過程[3]。眾所周知，腫瘤細(xì)胞的促血管生成過程與很多細(xì)胞因子有關(guān)，如生長(zhǎng)因子，腫瘤壞死因子-α、趨化因子、P53和成纖維生長(zhǎng)因子2等，但在本研究中，筆者選擇了在腫瘤組織和正常組織呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)的促血管再生因子VEGF和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白Del1[4-5]。腫瘤中酸性、低氧的腫瘤微環(huán)境，可以誘導(dǎo)VEGF的大量表達(dá)[6]。VEGF可以通過旁分泌促進(jìn)局部微血管的新生，從而為腫瘤細(xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，起到了促血管生成的作用。與此同時(shí)，VEGF也可以通過自分泌起到血管透性因子的作用，從而影響腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡的細(xì)胞行為，以及干擾宿主抗原提成和加工等免疫過程，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。此外，在腫瘤細(xì)胞中，VEGF蛋白與KDR基因發(fā)生互作以后，共同激活MAPK級(jí)聯(lián)通路，從而增加了HSP90蛋白的表達(dá)從而誘導(dǎo)了BCL2基因的過表達(dá)，最終抑制了細(xì)胞的凋亡過程[8]。因此，可以通過用RNAi技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對(duì)VEGF基因的沉默，從而使得細(xì)胞的凋亡過程不受抑制，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞增殖的抑制。對(duì)于DEL1基因的作用，Chiaki Hidai等[9]首次在1997年的小鼠胚胎研究中進(jìn)行了報(bào)道報(bào)道，DEL1基因在受精后9 d的胚胎中表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)，而后微血管的密度逐漸加大，隨著血管網(wǎng)絡(luò)的日趨成熟，DEL1的表達(dá)量又開始逐漸下降，直到出生后Del1的表達(dá)量不呈現(xiàn)差異表達(dá)。這也就說明與血管生成調(diào)節(jié)因子（flk1）和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子（CD31）的作用類似，DEL1在胚胎發(fā)育的不同階段呈現(xiàn)特定的表達(dá)模式[10]。這些內(nèi)皮細(xì)胞的變化的標(biāo)志物，提示Del1對(duì)于血管細(xì)胞的生成和內(nèi)皮細(xì)胞的變化具有很重要的調(diào)節(jié)作用。本研究利用轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染pshRNAVEGF質(zhì)粒和同時(shí)轉(zhuǎn)染pshRNA-Del1+pshRNA-VEGF質(zhì)粒對(duì)裸鼠的移植腫瘤進(jìn)行RNAi治療，結(jié)果顯示無論是抑制Del1還是抑制VEGF蛋白的翻譯都可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。但是對(duì)比這兩組之間的腫瘤生長(zhǎng)情況，未見差異。該結(jié)果顯示Del1和VEGF都可以作為抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物靶點(diǎn)。進(jìn)一步來說，本研究中也發(fā)現(xiàn)協(xié)同的抑制Del1和VEGF兩個(gè)蛋白對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，以及腫瘤細(xì)胞的微血管密度都有更好的抑制作用，因此，在今后的研究中可以考慮同時(shí)抑制Del1和VEGF兩個(gè)蛋白，以期望取得更好的治療效果。

[1]Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,et al.RNAi:double stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell,2000,101(1):25-33.

[2]Xiaolong Zou,Haiquan Qiao,Xian Jiang,et al.Down regulation of developmentally regulated endothelial cell locus-1 inhibits the growth of colon cancer[J].Journal of Biomedical Science,2009,16(1):33.

[3]Mulkeen AL,Silva T,Yoo PS,et al.Short interfering RNA-mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor:effects on cellular proliferation in colon cancer cells[J].Arch Surg,2006,141(4):367-374.

[4]Wannenes F,Ciafre SA,Niola F,et al.Vector-based RNA interference against vascular endothelial growth factor-A significantly limits vascular rization and growth of prostate cancer in vivo[J].Cancer Gene Ther,2005,12(12):926-934.

[5]Murata M,Takanami T,Shimizu S,et al.Inhibition of ocular angiogenesis by diced small interfering RNAs(siRNAs)specific to vascular endothelial growth factor(VEGF)[J].Curr Eye Res,2006,31(2):171-180.

[6]Shweiki D,Itin A,Soffer D,Keshet E.Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis[J].Nature,1992,359(6398):843-845.

[7]楊英.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在腫瘤中的作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):腫瘤學(xué)分冊(cè),2004,12(31):18-20.

[8]DiasS,ShmelkovSV,LamG,etal.VEGF(165)promotessurvivalofleukemic cells by HSP90-mediated induction of bcl-2 expression and apoptosis inhibition[J].Blood,2002,99(7):2532-2540.

[9]Hidai C,Zupancic T,Penta,et al.Cloning and characterization of developmental endothelial locus-1:An embryonic endothelial cell protein that binds the avb3 integrin receptor[J].Genes Dev,1998,12:21-33.

[10]Millauer B,Wizigmann-Voos S,Schnurch H,et al.High affinity VEGF binding and developmental expression suggest flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis[J].Cell,1993,72(6):835-846.