羅文舒，饒曉丹，吳永剛，曹雪梅，于海波，皮 敏，楊卓欣，劉遠(yuǎn)聲

廣東省深圳市中醫(yī)院針灸科，廣東 深圳 518033

缺血性腦血管病是嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的疾病[1-2]，缺血再灌注損傷是其常見(jiàn)的病理過(guò)程，細(xì)胞凋亡是其重要的病理環(huán)節(jié)。半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）是介導(dǎo)兩條主要凋亡途徑的關(guān)鍵性的酶，凋亡信號(hào)傳遞至Caspase-8可使之活化，從而啟動(dòng)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。針灸作為腦梗死的有效治療手段，在其病理過(guò)程中可起重要作用。本研究觀察針刺督脈經(jīng)穴對(duì)腦缺血細(xì)胞凋亡和Caspase-8蛋白表達(dá)的影響，探討針刺督脈經(jīng)穴腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

以 SD 大鼠為受試對(duì)象，雄性，體重（200±30）g。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在22～28℃之間。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺對(duì)照組、針刺督脈組4組，各30只。

1.2 造模方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10%水合氯醛腹腔麻醉（35 mg/100 g體重），仰臥于手術(shù)臺(tái)，參考Kuge造模法[3]，局部常規(guī)消毒，頸正中切開(kāi)，先后分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），離斷 ECA的分支，結(jié)扎并游離 ECA主干一段。在游離出的ECA剪一小口，將制備好的尼龍線（直徑0.205 mm）插入ECA內(nèi)，經(jīng)CCA分叉處通過(guò)ICA至大腦前動(dòng)脈（ACA），尼龍線插入深度平均為（18.5±0.5）mm，以完全阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCA）血供。缺血2 h時(shí)向外拉尼龍線使其球端回至ECA內(nèi)，此時(shí)即可恢復(fù)右側(cè)MCA血供，形成缺血再灌注。

1.3 治療參數(shù)

假手術(shù)組和模型組于術(shù)后即如針刺組大鼠般固定于針刺操作臺(tái)上20 min，不做任何治療，每12小時(shí)1次。針刺對(duì)照組和針刺督脈組術(shù)后即予針刺，持續(xù)時(shí)間為20min，每12小時(shí)1次。穴位定位參考人民衛(wèi)生出版社1997年第1版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中大鼠的百會(huì)、風(fēng)府、氣海、關(guān)元取穴方法。將大鼠固定，針刺后采波10 Hz），電壓3～5 V，電流1 mA，以身體出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為準(zhǔn)。

1.4 取材

受試動(dòng)物再灌注后 3、6、12、24、72 h后處死，每組每個(gè)時(shí)間段處死6只。10%水合氯醛腹腔過(guò)量麻醉，以生理鹽水灌注，再以4%多聚甲醛內(nèi)固定，取出腦組織，4%多聚甲醛固定24～48 h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液至沉底，石蠟包埋切片備用。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 腦組織凋亡細(xì)胞的原位檢測(cè) （TUNEL法）切片以1%的過(guò)氧化氫處理10 min，加0.01 M TBS 1:200新鮮稀釋蛋白酶K 37℃消化1 min，每片切片取末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和 DIG-d-UTP 各 1 μl，加入 18 μl標(biāo)記緩沖液中混勻。甩去片上多余液體后加標(biāo)記液20 μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2 h。加封閉液 50 μl/片，室溫 30 min，加抗體稀釋液1:100稀釋生物素化抗地高辛抗體50 μl/片，37℃反應(yīng)30 min，SABC（1:100）50 μl/片加至標(biāo)本片上，37℃反應(yīng) 30 min，DAB 顯色，脫水、透明、封片，鏡檢。

表1 各組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞原位檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（，個(gè)）

表1 各組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞原位檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（，個(gè)）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與組內(nèi)其他時(shí)間段比較，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.01

組別 只數(shù) 3 h（n=6）假手術(shù)組模型組針刺對(duì)照組針刺督脈組303030302.34±0.6214.54±3.18①11.85±3.5210.43±2.836 h（n=6）2.51±0.2717.62±2.73①16.85±4.1914.87±3.2612 h（n=6）2.42±0.3329.47±4.29①27.43±3.4126.18±2.7224 h（n=6）2.78±0.3648.75±3.61①②35.68±2.74③37.81±4.12③72 h（n=6）2.65±0.525.14±1.25①4.35±1.814.84±1.32

表2 各組大鼠腦組織頂葉皮層Caspase-8蛋白表達(dá)的平均灰度值（）

表2 各組大鼠腦組織頂葉皮層Caspase-8蛋白表達(dá)的平均灰度值（）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與組內(nèi)其他時(shí)間段比較，②P＜0.05；與模型組比較，③P＜0.05

組別 只數(shù) 3 h（n=6）假手術(shù)組模型組針刺對(duì)照組針刺督脈組30303030175.24±12.32153.41±10.34①158.76±14.53159.52±12.736 h（n=6）178.72±9.53141.52±11.36①150.16±13.62148.61±10.9612 h（n=6）173.51±13.86129.28±7.51①②138.83±13.85141.54±12.8424 h（n=6）176.27±11.92145.43±8.93①159.32±10.23③162.72±11.63③72 h（n=6）179.67±14.45156.52±7.48①169.28±11.97③171.42±14.49③

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色 （SABC法）檢測(cè)Caspase-8表達(dá)：用Caspase-8多克隆抗體進(jìn)行SABC免疫組織化學(xué)染色，采用撈片法，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每個(gè)腦區(qū)取4張切片。切片常規(guī)脫蠟至水，30%H2O21份加蒸餾水10份混合，室溫5～10 min以滅活內(nèi)源性酶，抗原熱修復(fù)，滴加兔抗Caspase-8多克隆抗體（1:100）20℃ 2 h，4℃過(guò)夜，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，室溫20 min，滴加鏈霉素親和素一生物素復(fù)合物（SABC，1:100），室溫下孵育2 h，DAB顯色，脫水，透明，封片，鏡檢。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺督脈經(jīng)穴對(duì)腦缺血細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在各觀察時(shí)間點(diǎn)，相對(duì)假手術(shù)組，大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）后凋亡細(xì)胞明顯增多；在MCAO 24 h后，針刺督脈組與模型組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；針刺督脈組與針刺對(duì)照組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果參見(jiàn)表 1。

2.2 針刺督脈經(jīng)穴對(duì)腦缺血腦組織Caspase-8蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組在各時(shí)間點(diǎn)Caspase-8蛋白表達(dá)的平均灰度值降低，提示Caspase-8蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，在MCAO 12 h其平均灰度值降至最低點(diǎn)，其后時(shí)間點(diǎn)其平均灰度值又有所升高；在MCAO 24 h和72 h，針刺督脈組與模型組比較，Caspase-8蛋白表達(dá)的平均灰度值提高（P＜0.05），與針刺對(duì)照組比較，平均灰度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表 2。

3 討論

腦細(xì)胞對(duì)缺血缺氧非常敏感，腦梗死后，梗死灶中心區(qū)以細(xì)胞死亡為主，而周邊半暗區(qū)病理改變以細(xì)胞凋亡為主，挽救半暗區(qū)缺血缺氧的腦細(xì)胞，對(duì)減輕缺血再灌注損傷具有重要意義。

腦梗死后的細(xì)胞凋亡的機(jī)制非常復(fù)雜，Caspase家族在其中發(fā)揮了重要作用。凋亡過(guò)程雖然可由多種因素啟動(dòng)，但凋亡通路卻相對(duì)保守，可分為外源性和內(nèi)源性凋亡通路，二者都通過(guò)關(guān)鍵的Caspase-8蛋白調(diào)控凋亡過(guò)程[4]。實(shí)驗(yàn)表明，腦梗死后Caspase-8蛋白表達(dá)水平上升，這一過(guò)程與腦細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過(guò)程基本相符，提示致病因素引起的Caspase-8水平改變與腦細(xì)胞凋亡的病理過(guò)程密切相關(guān)。

針灸應(yīng)用于中風(fēng)急性期治療，在腦保護(hù)方面越來(lái)越引起人們的關(guān)注[5]，臨床上重視應(yīng)用督脈和任脈經(jīng)穴治療中風(fēng)病，取得了很好的療效[6]。《難經(jīng)·二十八難》云“督脈者起于下極之腧，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”，《素問(wèn)·骨空論》曰督脈“上額交巔上，入絡(luò)腦”，明確指出督脈在循行上與腦密切相關(guān)。督脈為陽(yáng)脈之海，同時(shí)與諸經(jīng)交匯，通過(guò)將十四經(jīng)臟腑氣血上輸于腦，以奉養(yǎng)元神，可見(jiàn)督脈對(duì)腦功能的正常發(fā)揮具有重要意義。故歷代醫(yī)家多應(yīng)用督脈經(jīng)穴治療中風(fēng)所引起的神志障礙、言語(yǔ)肢體功能障礙等。而任脈為陰脈之海，與督脈共同協(xié)調(diào)機(jī)體陰陽(yáng)功能。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，針刺督脈治療在腦梗死24 h即可減少凋亡細(xì)胞數(shù)，在腦梗死24 h和72 h即可下調(diào)其Caspase-8蛋白表達(dá)，而針刺任脈經(jīng)穴亦有類似效果，提示針刺督脈治療腦梗死，可能通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-8表達(dá)水平，減少腦細(xì)胞凋亡，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷起腦保護(hù)作用。

[1]汪關(guān)寶,楊少琴,史影,等.北京市中關(guān)村地區(qū)心腦血管病病死率及防治策略的流行病學(xué)研究[J].心肺血管病雜志,2010,29(4):261-265.

[2]李云鵬,柳勝生,蘇旭燕,等.上海市松江區(qū)2001-2008年腦卒中流行病學(xué)分析[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,22(1):22-24.

[3]Kuge Y,Minematsu K,Yamagachi T,et al.Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats [J].Stroke,1995,26(9):1665.

[4]Kischkel FC,Lawrence DA,Chuntharapai A,et al.Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptor 4 and 5[J].Immunity,2000,12:611-620.

[5]王鵬琴,白麗,蔡虹,等.眼針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織半暗區(qū)Caspase-8、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 [J].針灸臨床雜志,2010,26(9):51-54.

[6]羅文舒.針灸任督脈治療中風(fēng)后尿失禁的臨床研究[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,12(1):12-14.