向 暉，劉健民，楊小蘭，孫 衛(wèi)，張建中，萬登峰，何錦華，梁愛軍，冷景興，周 超，古金海

（江西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，南昌330006）

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科最常見的惡性腫瘤，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移往往是患者腫瘤復(fù)發(fā)，預(yù)后不良的重要原因。定期影像學(xué)（CT、MRI）復(fù)查是目前監(jiān)測(cè)病程，選擇治療方案的主要手段。近年來發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶－2（MMP－2）與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤患者血清中MMP－2的含量明顯高于正常人。本研究通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)期血清MMP－2的含量，結(jié)合同期影像學(xué)檢查，研究在腦膠質(zhì)瘤病程演變過程中MMP－2的變化，為臨床上對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者適時(shí)選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨柑峁┮罁?jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本組30例均為2006年5月至2008年9月在江西省人民醫(yī)院行手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤患者，按照Kernohan分類法將腦膠質(zhì)瘤分為Ⅰ－Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ－Ⅱ級(jí)10例，Ⅲ級(jí)10例，Ⅳ級(jí)10例。30例中男19例，女11例，年齡14～70歲，平均55.3歲。

1.2 血清標(biāo)本采集

每位患者均于術(shù)后3、6、12個(gè)月復(fù)查頭部平掃及增強(qiáng) MRI，同時(shí)采血。清晨采集空腹靜脈血5mL，2 000r·min－1離心10min，取血清于－4℃保存。

1.3 血清MMP－2的含量測(cè)定

采用明膠酶譜測(cè)定法。血清標(biāo)本經(jīng)1∶200稀釋，上樣20μL置于含0.1%明膠的8%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行SDS－PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠置于洗脫液中震蕩洗脫2次，每次45min；然后用漂洗液漂洗2次，每次20min。接著，將凝膠置于孵育液中孵育42h。孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色3h，脫色液 A、B、C 分別脫色0.5、1、2h后顯示出MMP－2為位于藍(lán)色背景上的透亮帶。此凝膠經(jīng)2038Image System成像并以反轉(zhuǎn)模式打印，使酶解活性表現(xiàn)為白色背景上的黑色條帶，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)讀取條帶面積和灰度。條帶酶解量＝條帶面積×（條帶灰度－背景灰度），以比活［比活＝酶解量÷樣品蛋白濃度，單位：灰度面積（s）·g－1·L－1］反映酶的含量。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定用改良lowerys法。

1.4 免疫印跡法定性

SDS－PAGE凝膠取下后放于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20min，將與其同等大小的硝酸纖維素（NC）膜濾紙浸濕。依次加上濾紙、NC膜、凝膠、濾紙，轉(zhuǎn)移1.5h，取出 NC膜加入0.2%麗春紅染液5～10min，顯色后標(biāo)注好蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的位置，去離子水沖至色退。5mL封閉緩沖液封閉1～2h。加入含一抗（羊抗人 MMP－2抗體，美國(guó)R＆D公司產(chǎn)品）緩沖液，4℃孵育2～4h，用PBS緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入含兔抗羊IgG－HRP緩沖液（pH 7.5），室溫孵育1h，TBS緩沖液洗滌3次，每次10min。加入底物溶液顯色至出現(xiàn)棕色反應(yīng)帶，立即取出置于PBS溶液中清洗保存。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間差異用one－way ANOVA法，兩兩比較用SNK法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清MMP－2含量檢測(cè)結(jié)果

腦膠質(zhì)瘤患者不同分級(jí)術(shù)前術(shù)后血清MMP－2含量比較見表1。表1結(jié)果顯示：Ⅲ、Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)前術(shù)后血清MMP－2含量均顯著高于Ⅰ－Ⅱ級(jí)患者血清 MMP－2含量（P＜0.01）；而與術(shù)前相比，各級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者血清MMP－2含量術(shù)后均明顯降低（P＜0.01）。術(shù)后12個(gè)月行 MRI檢查，Ⅰ－Ⅲ級(jí)無復(fù)發(fā)病例，Ⅳ級(jí)復(fù)發(fā)7例，血清MMP－2含量為（276±21）s·g－1·L－1，較未復(fù)發(fā)3例（35±4）s·g－1·L－1明顯升高（P＜0.01）。

表1 不同時(shí)間患者血清MMP－2含量，s·g－1·L－1

表1 不同時(shí)間患者血清MMP－2含量，s·g－1·L－1

分級(jí) n 術(shù)前 術(shù)后3個(gè)月 6個(gè)月 12個(gè)月Ⅰ－Ⅱ級(jí) 10 55±18 9±3△ 9±4△ 10±4△Ⅲ級(jí) 10 253±56＊ 82±7＊△ 23±4＊△ 20±2＊△Ⅳ級(jí) 10 356±65＊ 98±29＊△ 56±24＊△ 204±18＊△＊P＜0.01與Ⅰ－Ⅱ級(jí)比較；△P＜0.01與術(shù)前比較。

2.2 免疫印跡法結(jié)果

含MMP－2的血清樣本經(jīng)SDS－PAGE電泳后進(jìn)行 Western blot分析，MMP－2可被抗 MMP－2單克隆抗體所識(shí)別而發(fā)生顯色反應(yīng)，在相對(duì)分子質(zhì)量約72 000處有一條帶；而陰性對(duì)照與該抗體無顯色反應(yīng)。這證實(shí)血清樣本中確實(shí)含有MMP－2，相對(duì)分子質(zhì)量為72 000。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)和術(shù)后復(fù)發(fā)是臨床治療療效差和患者死亡的主要原因之一?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）因能降解結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)大分子導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過程而引起了廣泛的關(guān)注。MMPs是一類Zn2＋依賴性內(nèi)肽酶，具有降解各種細(xì)胞外基質(zhì)成分的作用，在正常組織器官發(fā)育、創(chuàng)傷愈合新生血管形成、骨的生成與重塑、巨噬細(xì)胞游走及軸突生長(zhǎng)等生理過程中發(fā)揮重要作用。

近年來對(duì)MMPs的研究日漸深入。MMPs家族成員均具備以下幾個(gè)基本特點(diǎn)：1）每一種酶至少能降解一種ECM成分；2）均以酶原的形式分泌到ECM中，在一定的條件下被激活而發(fā)揮作用；3）其活化需要Zn2＋和Ca2＋的參與，以發(fā)揮蛋白水解酶的活性。惡性腫瘤在侵襲過程中，必須首先黏附到ECM，繼而靠蛋白水解酶降解ECM，然后瘤細(xì)胞在動(dòng)力因子的作用下向被蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域移動(dòng)［1］。在降解 ECM 的多種蛋白水解酶中 MMPs起最主要的作用。MMPs由于能降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分ì型膠原，而被認(rèn)為與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)［2］。其中 MMP－2是人體內(nèi)分布最廣泛的一類蛋白水解酶，且其作用底物也最廣，MMP－2參與正常及病理情況下的細(xì)胞外基質(zhì)重塑、血管發(fā)生以及細(xì)胞遷移。

在正常穩(wěn)定狀態(tài)下，腦組織中極少有 MMP－2的表達(dá)，在炎性細(xì)胞、激素、生長(zhǎng)因子刺激下細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中其表達(dá)數(shù)量升高。MMP－2在瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯，主要與腦膠質(zhì)瘤的侵襲性和血管生成有關(guān)，尤其在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤內(nèi)呈高表達(dá)，與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)［3］。MMP－2水平的增加可作某些腫瘤侵入組織、轉(zhuǎn)移的標(biāo)志［4－5］。具有侵襲能力的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系分泌大量的MMP－2，同時(shí)其侵襲力與MMP－2表達(dá)水平存在密切關(guān)系［6－7］。

應(yīng)用Northern印跡和免疫組化技術(shù)對(duì)臨床組織標(biāo)本檢測(cè)表明，腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中存在 MMP－2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平亦明顯增加。明膠酶譜分析顯示，在不同級(jí)別的膠質(zhì)細(xì)胞瘤中均存在 MMP－2的前體，而隨著腫瘤惡性程度的增加，活化形式的 MMP－2也隨之增加［8－10］。

本研究通過測(cè)定不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者血清中MMP－2含量證實(shí)，血清中MMP－2的含量與腫瘤的惡性程度相關(guān)，隨惡性程度的增高而增加，腫瘤復(fù)發(fā)患者血清中 MMP－2含量亦增高。血清MMP－2含量能否作為腫瘤預(yù)后判斷與腫瘤復(fù)發(fā)的診斷指標(biāo)還存在2個(gè)問題，第一是檢測(cè)方法繁瑣，準(zhǔn)確性相對(duì)較差；第二是沒有大樣本統(tǒng)計(jì)證實(shí)，無法確定臨界值。

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