程 悅，符 影，王志宇，楊得坡，陳建萍，王冬梅

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，香港)

雞血藤為豆科密花豆屬植物密花豆SpatholobussuberectusDunn.的干燥藤莖。中醫(yī)認(rèn)為其具有補(bǔ)血、活血、通絡(luò)之功效，臨床上常用雞血藤治療貧血、各種原因(如放療、化療)引起的白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞等全血象減少和再生障礙性貧血等疾病，具有較好的療效[1]。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，它還有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠等作用[2]。迄今為止，從雞血藤中發(fā)現(xiàn)的化合物結(jié)構(gòu)類型主要有黃酮類、萜類、甾醇類、蒽醌類、內(nèi)酯類、揮發(fā)油類等類型的化合物，近年來，對(duì)雞血藤的化學(xué)成分研究主要集中在黃酮類化合物[3-11]，而其他結(jié)構(gòu)類型的化合物研究較少。

經(jīng)過對(duì)雞血藤/φ=60%醇提物化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除黃酮類、萜類、蒽醌及其苷、香豆素及其苷、酚類化合物的系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果為陽性外，縮合鞣質(zhì)的特征反應(yīng)結(jié)果也為陽性，但已有文獻(xiàn)中并無任何關(guān)于雞血藤中含有縮合鞣質(zhì)類成分的報(bào)道。

縮合鞣質(zhì)，又稱為原花青素，是一類廣泛存在于植物界的多酚類物質(zhì)?？s合鞣質(zhì)由兒茶素或沒食子酸兒茶素等黃烷-3-醇類化合物以碳-碳鍵聚合而形成的化合物，通常三聚體以上才具有鞣質(zhì)的性質(zhì)，根據(jù)其黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)的差別分為procyanidins和prodelphinins?？s合鞣質(zhì)具有多種顯著的生物活性，其抗氧化和抗癌活性的研究已備受關(guān)注[12]。

故本論文對(duì)雞血藤/φ=60%醇提物及其不同極性溶劑萃取部位中的縮合鞣質(zhì)及總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)考察了各萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性，可對(duì)雞血藤抗腫瘤活性部位的制備提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 供試材料

雞血藤藥材，產(chǎn)地廣西，購自香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院臨床教研中心大藥房，經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥化實(shí)驗(yàn)室楊得坡教授鑒定為豆科密花豆屬植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的藤莖。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀ELK-800型(Bio-Tek)，倒置顯微鏡(TS100F，日本NIKON公司)，HPLC色譜儀： LC-20AB泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器(日本島津公司)，Ultimate AQ-C18色譜柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm，美國Welch公司)，Millipore超純水系統(tǒng)，通用水套CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

DMEM培養(yǎng)基、1640 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)，胎牛血清(FBS)(美國Hyclone 公司)，四甲基噻唑藍(lán)(MTT)、dm5825抗生素(青、鏈霉素)、兒茶素均購自美國Sigma 公司，芒柄花素(w> 99%，HPLC，西安慈緣生化科技有限公司)，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、甲醇、硫酸、香草醛為國產(chǎn)分析純?cè)噭Ｈ巳橄侔┘?xì)胞MCF-7和人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29均由香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 雞血藤/醇提物及其各萃取部位的制備

將雞血藤藥材1.5 kg，經(jīng)粉碎后，加入10倍φ=60%乙醇超聲提取2次，每次1 h，減壓回收溶劑后，得到雞血藤/φ=60%醇提物(以下簡(jiǎn)稱醇提物)約195 g。稱取180 g醇提物均勻分散于適量的水溶液中，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得石油醚萃取物、乙酸乙酯不溶物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物和水層留余物，其結(jié)果如表1所示。

表1 雞血藤醇提物各萃取部位的收率

2.2 雞血藤醇提物及各萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性

采用噻唑蘭(MTT)法測(cè)定雞血藤醇提物及各個(gè)萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性。人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29培養(yǎng)在含RPMI1640培養(yǎng)液中(含100 mL/L加熱滅活胎牛血清，青霉素，鏈霉素各10×105U/L)，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7培養(yǎng)在含DMEM培養(yǎng)液中(含100 mL/L加熱滅活胎牛血清，青霉素，鏈霉素各10×105U/L)，培養(yǎng)條件為37 ℃，φ=5% CO2，2～3 d換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各細(xì)胞每孔100 μL接種于96孔板，細(xì)胞濃度為5×104/mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基，24 h后吸除舊培養(yǎng)基，再分別加入90 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL 500 μg/mL的藥液(含0.2% DMSO)，使藥液終濃度為50 μg/mL；空白對(duì)照組加入10 μL含0.2% DMSO的磷酸鹽緩沖液，每組設(shè)6個(gè)平行孔，置于37 ℃、φ=5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。之后加入10 μL的5 mg/mL的MTT溶液，再培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加150 μL DMSO，輕輕振蕩15 min，待完全溶解顯色后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)每孔的吸光度A值，按照如下公式求出增殖抑制率，結(jié)果如表2所示。

抑制率=[(對(duì)照組平均A值-藥物組平均A值) /對(duì)照組平均A值]×100 %

表2 雞血藤/醇提物及各萃取部位對(duì)HT-29和MCF-7細(xì)胞增殖的抑制活性

2.3 雞血藤醇提物及各萃取部位的高效液相色譜分析

以乙腈和水為流動(dòng)相，乙腈濃度(φ)10%(0 min)-15%(10 min)-30%(35 min)-60%(45 min)-90%(60 min)-90%(70 min)；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；結(jié)果如圖1所示。雞血藤/醇提物、乙酸乙酯不溶物、正丁醇萃取物有明顯的“包峰”，表明其中可能含有大分子物質(zhì)。

圖1 雞血藤醇提物及各萃取物的HPLC分析圖譜(250 nm)

2.4 雞血藤醇提物及各萃取部位總黃酮含量測(cè)定

由于雞血藤中黃酮類化合物以芒柄花素的含量較高，故以其作為雞血藤總黃酮含量測(cè)定的指標(biāo)成分。在一定濃度范圍內(nèi)，芒柄花素的濃度與其最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度成正比，可以通過吸光度的測(cè)定來計(jì)算雞血藤樣品中總黃酮的濃度。由于雞血藤/石油醚萃取物的收率很低且其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性很弱，故不對(duì)其進(jìn)行總黃酮和鞣質(zhì)的含量測(cè)定。

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芒柄花素對(duì)照品5.2 mg，用少量φ=95%乙醇溶解后置25 mL容量瓶中，并用φ=95%乙醇稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.208 mg/mL)。

2.4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 將對(duì)照品溶液在200～800 nm范圍進(jìn)行掃描，在250 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選用250 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4.3 供試品溶液的制備及測(cè)定 精密稱取醇提取物和各萃取物樣品各約1 mg， 置10 mL容量瓶中，加入φ=95% 乙醇 1 mL，超聲溶解，用φ=95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得供試液，用紫外分光光度法測(cè)定供試品溶液的A250，計(jì)算其中總黃酮的含量。

2.4.4 含量測(cè)定的方法學(xué)考察

1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍。

精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入φ=95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，在250 nm處測(cè)定吸收度。以對(duì)照品吸光度A250(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液的濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，總黃酮濃度在2.08～10.40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.116 9X+0.146 4，R2=0.999 9。

2)精密度試驗(yàn)。

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.3 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入φ=95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，連續(xù)測(cè)定6次A250， RSD為0.20%，表明儀器精密度良好。

3)重復(fù)性試驗(yàn)。

分別精密稱取1 mg雞血藤醇提物 6份，按照2.4.3項(xiàng)下制備供試液樣品6份并分別測(cè)定A250，計(jì)算總黃酮含量均值為6.58%，RSD為1.69%，表明該方法重復(fù)性良好。

4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。

精密稱取1 mg雞血藤醇提物，按照2.4.3項(xiàng)下制備供試液樣品，同一供試液分別于第0、1、2、4、8、16 h進(jìn)行測(cè)定A250，共測(cè)定6次，RSD為0.65%，表明樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

5)加樣回收率試驗(yàn)。

稱取0.5 mg已知總黃酮含量的雞血藤醇提取物9份，分別加入相當(dāng)于其含量120%(高濃度)、100%(中濃度)、80%(低濃度)的芒柄花素對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行3份，按照2.4.3項(xiàng)下制備供試液樣品9份，并分別測(cè)定A250，結(jié)果如表3所示，加樣回收率為101.26%，RSD值為1.40%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表3 總黃酮含量測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)

2.4.5 雞血藤醇提物及各萃取部位中總黃酮的含量測(cè)定 分別稱取雞血藤醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物各3份，按照2.4.3項(xiàng)下制備供試液樣品溶液，并分別測(cè)定A250，計(jì)算其中的總黃酮含量，結(jié)果顯示，雞血藤/醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物的總黃酮含量分別為(6.49±1.99)%、(7.36±0.13)%、(9.35±0.22)%、(8.41±0.27)%、(4.48±1.53)%。

2.5 雞血藤醇提物及各萃取部位縮合鞣質(zhì)含量測(cè)定

采用香草醛硫酸法，酸性條件下，縮合鞣質(zhì)A 環(huán)的化學(xué)活性較高，其上的間苯二酚或間苯三酚可與香草醛發(fā)生縮合，產(chǎn)物在濃酸作用下形成有色的正碳離子。采用分光光度法測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣品中縮合鞣質(zhì)含量，硫酸作為反應(yīng)過程的催化劑[13]。經(jīng)過顯色反應(yīng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定香草醛甲醇溶液的體積濃度為3%，濃硫酸甲醇溶液的體積濃度為30%，避光顯色20 min為反應(yīng)條件。

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對(duì)照品52.59 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，為對(duì)照品貯備液(1.051 8 mg/mL)。

2.5.2 供試品溶液的制備 稱取醇提取物和各萃取物樣品各約2 mg，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，為供試品溶液。

2.5.3 縮合鞣質(zhì)含量測(cè)定方法 取供試品溶液0.5 mL，加入包有錫箔的試管中，分別加入2.5 mLφ=3%香草醛甲醇溶液和2.5 mLφ=30%濃硫酸甲醇溶液，搖勻，避光顯色20 min后，在500 nm處測(cè)定吸光度A500。

2.5.4 縮合鞣質(zhì)含量測(cè)定的方法學(xué)考察

1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍。

精密量取兒茶素對(duì)照品貯備液1、2、3、4、5 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，備用。分別取上述各濃度對(duì)照品溶液0.5 mL，按照2.5.3項(xiàng)下測(cè)定，以對(duì)照品溶液的濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)500(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，兒茶素對(duì)照品濃度在0.105 2～0.525 9 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=2.282 8X-0.119 9，R2=0.999 3。

2)精密度試驗(yàn)。

取對(duì)照品溶液0.5 mL，按照2.5.3項(xiàng)下測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次A500，RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

3)重復(fù)性試驗(yàn)。

精密稱取2 mg雞血藤醇提取物6份，按照2.5.2項(xiàng)下制備供試液，按照2.5.3項(xiàng)下測(cè)定A500，計(jì)算縮合鞣質(zhì)含量均值為51.71%，RSD為2.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。

精密稱取雞血藤醇提取物2 mg，按照2.5.2項(xiàng)下制備供試液，同一供試品溶液分別于第0、1、2、4、8、16 h按照2.5.3項(xiàng)下測(cè)定A500，共測(cè)定6次，RSD為3.12%，表明樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

5)加樣回收率試驗(yàn)。

稱取1.2 mg已知縮合鞣質(zhì)含量的雞血藤醇提取物9份，分別加入相當(dāng)于其含量120%(高濃度)、100%(中濃度)、80%(低濃度)的兒茶素對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行3份，按照2.5.2項(xiàng)下制備供試液樣品9份，按照2.5.3項(xiàng)下測(cè)定A500，結(jié)果如表4所示，兒茶素的加樣回收率為99.93%，RSD值為1.86%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表4 縮合鞣質(zhì)含量測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)

2.5.5 雞血藤醇提物及各萃取部位中縮合鞣質(zhì)的含量測(cè)定 分別稱取雞血藤醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物各3份，按照2.5.2項(xiàng)下制備供試液樣品，按照2.5.3項(xiàng)下測(cè)定A500，結(jié)果顯示，0.6 mg/mL雞血藤醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物的縮合鞣質(zhì)含量分別為(51.09±0.37)%、(52.34±4.73)%、(73.22±2.72)%、(83.11±5.87)%、(29.74±2.12)%。

3 討 論

由于縮合鞣質(zhì)分子中含有較多的酚羥基，性質(zhì)活潑，不穩(wěn)定，容易氧化，形成極性更大聚合度更高的復(fù)雜多聚體，與其他天然產(chǎn)物相比，分離鑒定都有較大難度，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成復(fù)雜，但卻有良好的生物活性。本論文首次報(bào)道中藥雞血藤中含有大量縮合鞣質(zhì)類化合物，并對(duì)雞血藤醇提物及各萃取部位的縮合鞣質(zhì)和總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定。

3.1 雞血藤醇提物及各萃取物的總黃酮和縮合鞣質(zhì)含量的差異

雞血藤醇提物中，總黃酮含量為(6.49±1.99)%，縮合鞣質(zhì)含量為(51.09±0.37)%，縮合鞣質(zhì)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于總黃酮。在各萃取部位中，總黃酮含量大小順序?yàn)橐宜嵋阴ポ腿∥?正丁醇萃取物>乙酸乙酯不溶物>水層留余物，縮合鞣質(zhì)含量的大小順序?yàn)檎〈驾腿∥?乙酸乙酯萃取物>乙酸乙酯不溶物>水層留余物?？芍傸S酮及縮合鞣質(zhì)均在正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物中含量較高，其次是乙酸乙酯不溶物，說明經(jīng)過萃取，雞血藤中的黃酮類化合物和縮合鞣質(zhì)得到了一定程度的富集。

3.2 雞血藤抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)的研究

雞血藤化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用多樣，多年來對(duì)其研究主要圍繞雞血藤刺激骨髓造血功能，對(duì)其抗腫瘤活性研究較少，近年來有文章報(bào)道雞血藤粗提物及其黃酮分離產(chǎn)物SSCE在細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平都表現(xiàn)出抗腫瘤活性[14-16]，具體的作用機(jī)制至今仍未被闡明，物質(zhì)基礎(chǔ)亦不明確。本論文研究結(jié)果顯示，雞血藤/醇提物及各萃取物對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的增殖均有一定程度的抑制活性，對(duì)MCF-7的抑制活性高于HT-29，其中正丁醇萃取物濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性明顯高于其它萃取物，抑制率為77.08%，且其縮合鞣質(zhì)含量高達(dá)83.11%，說明除了黃酮類化合物之外，縮合鞣質(zhì)也可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。正丁醇萃取物總黃酮和縮合鞣質(zhì)含量均較高，且對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用強(qiáng)，可作為雞血藤抗腫瘤的有效部位，為下一步抗腫瘤活性單體的獲得提供了指導(dǎo)。

3.3 雞血藤質(zhì)量控制方法的研究

目前對(duì)雞血藤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究尚很薄弱，而藥典中對(duì)雞血藤的質(zhì)量控制，只關(guān)注了芒柄花素單一化合物，因此雞血藤藥材現(xiàn)有的質(zhì)量控制方法有著很大的局限性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞血藤中縮合鞣質(zhì)含量遠(yuǎn)高于其它類型化合物，同時(shí)，黃酮類成分被認(rèn)為是雞血藤的活性成分[2]，因此本文通過建立雞血藤中的總黃酮和縮合鞣質(zhì)的含量測(cè)定方法，可為雞血藤藥材的質(zhì)量控制提供一定的參考和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭虎占. 中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用.雞血藤[M].北京:學(xué)苑出版社,1997:2539.

[2]鄧家剛, 梁寧, 周程艷,等.雞血藤藥效及作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)藥, 2006, 29(6): 311-313.

[3]崔艷君, 劉屏, 陳若蕓,等.雞血藤的化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,37(10):784-787.

[4]鄭巖,劉樺, 白焱晶,等.雞血藤黃酮類化合物的研究[J].中國中藥雜志,2008,33(2):251-253.

[5]崔艷君, 劉屏, 陳若蕓,等.雞血藤有效成分研究[J].中國中藥雜志,2005,30(2):121-123.

[6]YOON J S, SUNG S H, PARK J H, et al. Flavonoids from Spatholobus suberectus[J]. Archive of Pharmacal Research, 2004, 27(6): 589-582.

[7]LEE M H, LIN Y P, HSU F L, et al. Bioactive constituents ofSpatholobussuberectusin regulating tyrosinase-related proteins and mRNA in HEMn cells[J]. Phytochemistry, 2006, 67: 1262-1270.

[8]ZHANG S W, XUAN L X. New Phenolic Constituents from the stems ofSpatholobussuberectus[J]. Helvetica Chimica Acta, 2006, 89: 1241-1245.

[9]成軍, 梁鴻,王媛,等.中藥雞血藤化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志,2003, 28(12): 1153-1154.

[10]嚴(yán)啟新,李萍,胡安明,等.雞血藤化學(xué)成分的研究[J].中草藥,2003,34(10):876-878.

[11]嚴(yán)啟新,李萍,王迪,等.雞血藤脂溶性化學(xué)成分的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2001, 32(5):336-338.

[12]TOSHIHIKO S, SAEKO M, NINA M, et al. Apple (Maluspumila) procyanidins fractionated according to the degree of polymerization using normal-phase chromatography and characterized by HPLC-ESI/MS and MALDI-TOF/MS[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1102(1-2): 206-213.

[13]孫蕓,谷文英.硫酸-香草醛法測(cè)定葡萄籽縮合鞣質(zhì)含量[J].生產(chǎn)與科研經(jīng)驗(yàn),2003,29: 43-46.

[14]唐勇, 王笑民, 何薇,等.雞血藤提取物體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 13 (4) : 306-308.

[15]唐勇, 何薇, 王玉芝,等.雞血藤黃酮類組分抗腫瘤活性研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2007,13 (2) : 51-54.

[16]薛麗君,韓景光,李定光,等.雞血藤提取物的抗腫瘤作用研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2009, 25(1):3-4.