郭 冉，劉永堅(jiān)，田麗霞，夏 輝，王家慶

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066003；2. 中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所，廣東 廣州 510275)

隨著近幾年蝦的精養(yǎng)、半精養(yǎng)模式增多，對(duì)蝦對(duì)飼料的需求愈來(lái)愈大，因此人們愈來(lái)愈關(guān)注如何降低飼料成本?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中原料來(lái)源，玉米淀粉較之其他糖源在飼料加工工業(yè)中有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此，以玉米淀粉為糖源，研究凡納濱對(duì)蝦適宜的糖水平對(duì)實(shí)際生產(chǎn)的指導(dǎo)意義是不言而喻的。

一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)很多對(duì)蝦種類利用葡萄糖的能力很差，可能的解釋是通過(guò)肝胰腺吸收葡萄糖到達(dá)飽和后，產(chǎn)生抑制效應(yīng)阻礙了葡萄糖的再吸收[1]。很多研究者建議使用復(fù)雜的糖作為對(duì)蝦的糖源，如淀粉，蔗糖等[2]。淀粉在水解后被吸收，來(lái)自淀粉水解產(chǎn)生的葡萄糖比游離葡萄糖到達(dá)肝胰腺吸收葡萄糖飽和的時(shí)間要遲一些[1-4]。 Shiau 和Peng[4]認(rèn)為斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)玉米淀粉的利用比糊精和葡萄糖好，并且，能夠獲得較好的蛋白質(zhì)沉積率。然而，飼料中淀粉總含量或者被吸收的瞬時(shí)含量超過(guò)動(dòng)物機(jī)體對(duì)能量的需求時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橹驹隗w內(nèi)沉積，這一理論在哺乳動(dòng)物和魚類中以得到證實(shí)。當(dāng)機(jī)體攝入過(guò)量的碳水化合物時(shí)，通過(guò)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生大量丙酮酸，而丙酮酸是脂肪合成的中間物質(zhì)，可以進(jìn)入脂肪合成途徑形成長(zhǎng)鏈脂肪酸，因此過(guò)多的糖會(huì)轉(zhuǎn)變成能量在體內(nèi)以脂肪的形式儲(chǔ)存。生物體內(nèi)的脂肪主要在肝臟和脂肪組織儲(chǔ)存，對(duì)蝦體內(nèi)的脂肪主要在肝胰腺儲(chǔ)存，因此，研究脂肪在對(duì)蝦肝胰腺的儲(chǔ)存情況能夠幫助了解對(duì)蝦能量的去向。因此，對(duì)凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺進(jìn)行組織學(xué)研究能夠直觀說(shuō)明肝胰腺對(duì)脂肪的儲(chǔ)存情況及脂肪對(duì)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞的結(jié)構(gòu)影響。

生物體內(nèi)調(diào)節(jié)肝臟脂肪合成的關(guān)鍵性酶包括：異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，上述酶的活性和含量可以反映機(jī)體對(duì)脂肪的合成能力。但未見(jiàn)對(duì)蝦體內(nèi)脂肪合成酶研究的相關(guān)報(bào)道。因此，研究凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的脂肪合成酶系相關(guān)關(guān)鍵酶的活性對(duì)于深入探討凡納濱對(duì)蝦糖代謝能力是十分必要的。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生長(zhǎng)性能、蝦體組成、肝胰腺組織學(xué)研究和脂肪合成酶活性等指標(biāo)研究凡納濱對(duì)蝦對(duì)不同含量飼料淀粉水平利用能力。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料和養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)用蝦初始平均體質(zhì)量(0.96±0.02) g。正式實(shí)驗(yàn)前，將實(shí)驗(yàn)用蝦暫養(yǎng)在水族箱中，以商業(yè)飼料飽食投喂，馴養(yǎng)1周后分組開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，56 d后結(jié)束。

6種等氮飼料，分別以w為10%, 15%, 20%, 25%, 30% 和35%玉米淀粉為糖源。所有原料均為商業(yè)產(chǎn)品。

試驗(yàn)飼料配方和成分分析如表1所示。飼料按表1配方制成直徑1.5 mm的顆粒，置于60 ℃烘箱中，烘10 h，然后放-20 ℃冰箱保存。飼養(yǎng)試驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)流水過(guò)濾水族箱(350 L)中進(jìn)行，試驗(yàn)用水為天然海水(珠海，鹽度6‰～14‰)。光周期為12h：12h。每種飼料設(shè)置3個(gè)平行，每箱放蝦30尾。飽食投喂試驗(yàn)飼料。每天在06:00, 14:00和20:00投喂，共3次，投喂2 h后吸出剩余飼料，烘干稱重。每天測(cè)定水溫，每周測(cè)定溶氧、pH和氨氮含量。水溫平均為(26.7±1.0) ℃,水中溶氧量為(7.4±0.5) mg·L-1, pH值為8.0～8.5，氨氮含量為(0.5±0.1) mg·L-1。每天記錄對(duì)蝦死亡數(shù)目。

1.2 樣品的采集和分析

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使蝦空腹24 h后，從每箱隨機(jī)取蝦4尾，用紗布吸干水分，105 ℃烘至恒量制備全蝦樣品。另隨機(jī)取蝦5尾，分別取肝胰臟樣品。分別采用105 ℃常壓干燥法、凱氏定氮法、及550 ℃灼燒法測(cè)定全蝦的水分、粗蛋白、脂肪和灰分(A.O.A.C)，以3’5-二硝基水楊酸法測(cè)定飼料中糖含量[5]。肝胰腺組織切片采用H.E.染色[6]。

1.3 脂肪合成相關(guān)酶(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸-葡萄糖脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶)測(cè)定方法

按照美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校動(dòng)物科學(xué)系魚類營(yíng)養(yǎng)研究室的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[7]，試劑均購(gòu)自Sigma。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(STDEV)表示，經(jīng)單因子方差分析后，采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，差異顯著性水平為P<0.05。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS11.0。

表1 試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)組成

Table 1 Formulation and composition of experimental diets %

飼料配方123456w(魚粉)303030303030w(酪蛋白) 141414141414w(玉米淀粉) 101520253035w(纖維素) 30.1925.1920.1915.1910.195.19w(其他)1)15.815.815.815.815.815.8飼料成分組成 w(水分) 10.29.89.510.011.19.3w(粗蛋白) 37.837.737.737.837.637.6w(粗脂肪) 5.35.55.45.45.35.5w(灰分) 8.28.38.38.48.48.3w(淀粉) 12.917.021.528.431.036.9

1) 其他(w/%)：啤酒酵母 3；烏賊粉 2；蝦頭粉 3.5；大豆磷脂 1；魚油 Fish oil，1；豆油 1；膽堿(w=50%) 0.5；CaH2PO41；復(fù)合維生素 0.2；復(fù)合礦物鹽 0.5；Vc磷酸酯 0.1；褐藻酸鈉 2；Y2O30.01。其中，復(fù)合維生素(w/%): 氯化膽堿 5.55；肌醇 2.22；VC1.11；泛酸鈣 0.83；VB10.22；VB20.56；VB60.06；Vk0.06；葉酸 0.02；VB120.012；生物素 0.006；醋酸α-生育酚 0.44；纖維素 88.87。復(fù)合礦物鹽 (w/%): Ca(H2PO4) ·2H2O 12.29；calcium lactate 47.42；NaH2PO4·2H2O 4.20；NaCl 3.23；K2SO416.38；KCl 6.58；FeSO4·7H2O 1.07；ferric citrate 3.83；MgSO4·7H2O 4.42；Zn SO40.47； MnSO4·H2O 0.033；CuSO4·5H2O 0.022；CoCl2·6H2O 0.043；KIO40.022

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始4周后，高水平玉米淀粉組對(duì)蝦開(kāi)始出現(xiàn)死亡。8周后，凡納濱對(duì)蝦各組的增質(zhì)量率、成活率和SGR存在顯著性差異(P<0.05)(表2)。對(duì)蝦增質(zhì)量率隨著飼料玉米淀粉含量的增高而增高，在w=20%玉米淀粉含量組增質(zhì)量率開(kāi)始下降，飼料中玉米淀粉w=10%時(shí)，成活率最高(P<0.05)，w=15% 玉米淀粉組的SGR最高，但是與w=10%和20%玉米淀粉組沒(méi)有顯著性差異。隨著飼料淀粉含量增加，凡納濱對(duì)蝦的攝食量逐漸下降。以增質(zhì)量率為因變量，采用多項(xiàng)式方程，模擬得到凡納濱對(duì)蝦飼料中的適宜淀粉w為10%～20%(圖1)。

隨著飼料中淀粉含量的增加，全蝦水分、灰分和肝胰腺脂肪含量沒(méi)有顯著性差異，全蝦粗蛋白含量受飼料淀粉水平的影響(表3)，全蝦粗脂肪含量隨著飼料淀粉水平的增加而升高。

表2 不同玉米淀粉水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和飼料利用的影響1)

1) 結(jié)果用平均數(shù)和該處理的總標(biāo)準(zhǔn)誤(STDEV)表示 (n=3)。同組數(shù)據(jù)字母不同者表示有顯著性差異(P<0.05);增質(zhì)量率/%=[(Wt-Wo)/Wo]×100%; 特異生長(zhǎng)率(SGR)/%= [ln(Wt/尾數(shù))-ln(Wo/尾數(shù))]/t×100%; 成活率/%=(終末蝦尾數(shù)/初始蝦尾數(shù))×100%;W0為初始平均濕質(zhì)量，Wt為終末平均濕質(zhì)量，t為飼養(yǎng)天數(shù)

圖1 以增質(zhì)量率為因變量，以三次方程模擬凡納濱對(duì)蝦飼料適宜的糖含量。適宜的糖含量為(w)10%～20%。

2.2 組織學(xué)觀察

圖2顯示實(shí)驗(yàn)進(jìn)行8周后凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織切片。分別為飼喂w=10%和35% 淀粉飼料組對(duì)蝦肝胰腺切片。肝小管中脂肪小泡(白色箭頭所示)清晰可見(jiàn)，肝小管壁(黑色箭頭所示)的組織完整，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肝小管損傷。

2.3 酶學(xué)實(shí)驗(yàn)

由表4可見(jiàn)，凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺中只有蘋果酸脫氫酶可以測(cè)到，并隨著飼料淀粉水平的增加而顯著增加(P<0.05)，異檸檬酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及6-磷酸-葡萄糖脫氫酶活性檢測(cè)不出。

表3 不同糖水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)成分組成的影響

注：結(jié)果用平均數(shù)和該處理的總標(biāo)準(zhǔn)誤(STDEV)表示 (n=3)。同組數(shù)據(jù)字母不同者表示有顯著性差異(P<0.05)

圖2 飼料w(淀粉)= 10%和35%組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織切片 ×400

3 討 論

雖然魚蝦類也可以和陸上動(dòng)物一樣利用糖作為能量的來(lái)源，但在利用能力方面差別很大。一般來(lái)說(shuō)魚、蝦類利用糖類的能力比其他動(dòng)物低，對(duì)蝦更傾向于利用蛋白質(zhì)作為能源[8]。Rosas等[9]研究紅額角對(duì)蝦Litopenaeusstylirostris時(shí)發(fā)現(xiàn)，飼料中含有w=10%的糖不可以滿足對(duì)蝦對(duì)糖的需要，剩下的需要由蛋白質(zhì)提供能量。Tacon認(rèn)為不同種類的對(duì)蝦利用糖的能力依賴于它把過(guò)剩的能量轉(zhuǎn)化成脂肪和二級(jí)氨基酸的能力，在斑節(jié)對(duì)蝦P.monodon中，w=10%的玉米淀粉比w=40%的玉米淀粉好。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，當(dāng)飼料w(淀粉)在10%～20%時(shí)，凡納濱對(duì)蝦的增質(zhì)量率和SGR最大，顯著高于25%～35%的組。此結(jié)果與Rosas等的研究結(jié)果類似，他們認(rèn)為，凡納濱對(duì)蝦在鹽度較低的時(shí)候更適合利用高蛋白低糖的飼料。在本實(shí)驗(yàn)中，所用海水的鹽度為6‰～14‰，實(shí)驗(yàn)飼料蛋白質(zhì)水平相同，凡納濱對(duì)蝦對(duì)w(淀粉)=15%的飼料利用較好。

表4 淀粉水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺脂肪合成酶活性的影響1)

1) 結(jié)果用平均數(shù)和該處理的總標(biāo)準(zhǔn)誤(STDEV)表示 (n=3); 同組數(shù)據(jù)字母不同者表示有顯著性差異(P<0.05);

mU：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生的NADPH的摩爾數(shù); -：表示測(cè)不出或者測(cè)定出的含量極低

飼料w(淀粉)=10%組的凡納濱對(duì)蝦成活率最高，w(淀粉)為15%和20%組次之，其余組較低(P<0.05)，證明了凡納濱對(duì)蝦對(duì)糖的利用率比較低。本試驗(yàn)對(duì)蝦的成活率在w(淀粉)為20%和25%有明顯的分界線，分別為91%和66%，w(淀粉)為10%～20%組明顯高于w(淀粉)為25%～30%組(P<0.05)，從各組蝦的日攝食量可以看出，飼料w(淀粉)高的組(25%～35%)其日攝入量顯著低于飼料中w(淀粉)低的組(10%～20%)，分別為1.48～1.73和2.43～3.10，推測(cè)是由于隨著飼料糖含量的升高，飼料中可利用的能量水平也升高，導(dǎo)致對(duì)蝦攝食量下降引起的。

從蝦體組成來(lái)看，肝胰臟的脂肪水平、全蝦的水分和灰分均沒(méi)有顯著性差異；全蝦蛋白質(zhì)含量雖然在數(shù)值上差別不大，但是有隨糖含量升高而上升的趨勢(shì)，w(淀粉)=10%組體蛋白水平相對(duì)較低，而w(淀粉)=15%和w(淀粉)20%組與w(淀粉)=35%組沒(méi)有顯著性差異；全蝦的脂肪含量隨著淀粉含量的升高而升高。此結(jié)果與Alava的研究結(jié)果類似[10]。在Rosas等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)凡納濱對(duì)蝦飼料中的糖含量低時(shí)，對(duì)蝦會(huì)將飼料中的蛋白質(zhì)通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用分解作為能量利用。所以，糖含量低時(shí)對(duì)蝦的體蛋白沉積量也會(huì)偏低。當(dāng)糖含量過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)作為能量的消耗大大減少，由高糖產(chǎn)生的過(guò)剩的能量通過(guò)合成脂肪在體內(nèi)沉積，導(dǎo)致對(duì)蝦的體脂肪含量隨著飼料中糖含量的升高而升高。Kanazaw認(rèn)為可溶性淀粉不是從胃轉(zhuǎn)變成葡萄糖和海藻糖后被吸收進(jìn)入血淋巴，而是在中腸和肝胰臟被吸收。

在本實(shí)驗(yàn)中肝胰臟作為凡納濱對(duì)蝦能量物質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所，并沒(méi)有形成脂肪的積累，各組對(duì)蝦肝胰腺脂肪水平?jīng)]有顯著性差異(P>0.05)，這與實(shí)驗(yàn)中對(duì)6組處理的對(duì)蝦的肝胰臟的組織學(xué)切片的觀察也是一致的，雖然飼料w(淀粉)從10%升高到了35%，但是，肝胰臟的肝小管并沒(méi)有受到嚴(yán)重的損害，脂肪空泡區(qū)并不明顯，w(淀粉)=10%組和w(淀粉)=35%組的肝胰臟組織學(xué)沒(méi)有很大差異，高淀粉組也沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)肝胰臟的嚴(yán)重?fù)p害。這與Pascual[2]對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦P.monodon的研究不一致，他認(rèn)為當(dāng)斑節(jié)對(duì)蝦飼料中的糖蜜含量在w=10%時(shí)就會(huì)造成對(duì)肝胰臟的嚴(yán)重?fù)p傷，肝小管內(nèi)部細(xì)胞被破壞，僅剩下外部的連接組織。當(dāng)然，不同種類的對(duì)蝦對(duì)不同糖源的利用能力是不同的。

從凡納濱對(duì)蝦肝胰腺脂肪合成酶活性來(lái)看，隨著飼料淀粉水平的增加，肝胰腺蘋果酸脫氫酶的活性隨之顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明糖的增加誘導(dǎo)脂肪合成酶活性增強(qiáng)。其他幾種酶未檢測(cè)到，說(shuō)明凡納濱對(duì)蝦本身脂肪合成酶活性不高，或者含量很低，這也解釋了即使糖水平高達(dá)w=35%，凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺仍舊保持良好組織結(jié)構(gòu)的原因。推測(cè)吸收進(jìn)入血淋巴的過(guò)高濃度的葡萄糖沒(méi)有被有效的轉(zhuǎn)化生成脂肪，而有可能被直接排出體外。在魚類中有報(bào)道：攝食含糊化淀粉飼料后，魚體內(nèi)血漿葡萄糖含量迅速升高、而此時(shí)尚未產(chǎn)生足夠的相關(guān)代謝酶[12]，導(dǎo)致葡萄糖被大量排泄，使糊化淀粉利用率低下，進(jìn)而表現(xiàn)為生長(zhǎng)下降。

致謝:中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所魚類營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室梁桂英老師為本實(shí)驗(yàn)的順利完成提供了必要技術(shù)支持，在此表示感謝。

參考文獻(xiàn)：

[1]SHIAU S Y. Nutrient requirement of penaeid shrimp [J]. Aquaculture,1998, 164:77-93.

[2]PASCUAL F P, COLOSO R M and TAMSE C T. Survival and some histological changes inPenaeusmonodonFabricius juveniles fed various carbohydrates [J]. Aquaculture, 1983, 31: 169-180.

[3]ALAVA V R, PASCUAL F P. Carbohydrate requirements ofPenaeusmonodon(Fabricius) juveniles [J]. Aquaculture, 1987, 61: 211-217.

[4]SHIAU S Y, PENG C Y. Utilization of different carbohydrates at different dietary protein levels in grass prawn,Penaeusmonodon, reared in seawater [J]. Aquaculture,1992, 101: 241-250.

[5]YU S K, OLSEN C E , MARCUSSEN J. Methods for the assay of 1, 5-anhydro-D-fructose and α-1, 4-glucanlyase [J]. Carbohydrate Res, 1998, 305: 73-82.

[6]汪艷麗，蔡新華，韓金珠. 整塊組織HE染色方法的改進(jìn)[J]. 解剖學(xué)雜志, 1997, 20(5):508.

[7]WALZEM R L, STOREBAKKEN T, HUNG S S, et al. Relationship between growth and selected liver enzyme activities of individual rainbow trout [J]. J Nutrition,1991, 121:1090-1098.

[8]DALL W, HILL B J , ROTHLISBERG P C，et al. (陳楠生等譯). 對(duì)蝦生物學(xué)[M]. 青島：青島海洋大學(xué)出版社,1992.

[9]ROSAS C, CUZON G , GAXIOLA G. Influence of dietary carbohydrate on the metabolism of juvenileLitopenaeusstylirostris[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2000, 249: 181-198.

[10]ALAVA V R, LIM C. The quantitative dietary protein requirements ofPenaeusmonodonjuvenile in a controlled environment [J]. Aquaculture,1983,30:53-61.

[11]ROSAS C, CUZON G , GAXIOLA G. Metabolism and growth of juveniles ofLitopenaeusvannamei: effect of salinity and dietary carbohydrate levels [J]. Aquaculture, 2001, 259: 1-22.

[12]PIEPER A , PFEFFER F. Studies on the comparative efficiency of utilization of gross energy from some carbohydrate, protein and fats by rainbow trout (SalmogairdneriR.) [J]. Aquaculture,1980, 20: 323-332.