李 翠 王國(guó)林 王海云 羅猛強(qiáng)
腦缺血常伴有再灌注損傷,如何減輕這種損傷是臨床關(guān)注的重點(diǎn)之一,而臨床急性腦缺血發(fā)生的不可預(yù)測(cè)性,使得后處理具有更為廣闊的應(yīng)用前景。腦缺血患者圍手術(shù)期間麻醉藥物的選擇是麻醉醫(yī)師需要慎重考慮的問(wèn)題,近年來(lái),丙泊酚由于起效快、清除迅速和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉,其還能夠降低氧代謝率、抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡從而減輕腦缺血再灌注損傷[1-2]。研究顯示,丙泊酚后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷具有急性期保護(hù)作用[3]。這些研究大多限于損傷后8 d內(nèi),其是否具有長(zhǎng)時(shí)程保護(hù)作用目前尚不清楚。本研究旨在觀察丙泊酚后處理是否對(duì)腦缺血再灌注損傷具有長(zhǎng)時(shí)程保護(hù)作用,從而為臨床已發(fā)生或存在腦缺血潛在危險(xiǎn)患者麻醉藥物的選擇提供理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性SD大鼠144只,10~12周齡,體質(zhì)量250~280 g,購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。丙泊酚購(gòu)自意大利Astra Zeneca公司,脂質(zhì)溶劑(丙泊酚脂質(zhì)載體)類似物、10%脂肪乳注射液(C14~24)(intralipid)購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)購(gòu)自 Sigma 公司。大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)線栓購(gòu)自北京沙東生物技術(shù)有限公司,思路高TCI-Ⅰ型輸液泵購(gòu)自北京思路高科技發(fā)展有限公司,Morris水迷宮及分析軟件EthoVision(荷蘭Noldus公司)。
1.2 動(dòng)物模型的建立 參照Longa等[4]提出的可逆性MCAO線栓法加以改良制作局灶性腦缺血再灌注模型。10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉,右側(cè)股靜脈以小兒24號(hào)靜脈留置針插管,以備輸注液體,取頸正中切口,鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸外動(dòng)脈(external ca?rotid artery,ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA),并結(jié)扎右CCA、ECA近心端,根據(jù)大鼠個(gè)體不同選用不同球端直徑(0.24、0.26和0.28 mm)的栓線,于CCA分叉上方2 mm處將線栓球端置入ICA,沿ICA緩慢插入,向顱內(nèi)深入直到感覺(jué)有輕微阻力即止,以CCA分叉處為起點(diǎn),進(jìn)線長(zhǎng)度約為18~20 mm,此時(shí)大腦中動(dòng)脈(MCA)起始處血流被阻斷,固定好線栓,縫合切口,線栓尾端留于皮膚外。缺血60 min后拔出線栓至CCA內(nèi)進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組進(jìn)線深度為10 mm。術(shù)中和術(shù)后室溫控制在25℃~28℃,用電燈泡照射大鼠保暖以保持直腸溫度為(37.0±0.5)℃,以動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)以前肢為重的偏癱為造模成功。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為4組,每組36只大鼠,分別為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、脂質(zhì)溶劑對(duì)照組(I組)和丙泊酚后處理組(P組)。P組在再灌注即刻經(jīng)股靜脈給予丙泊酚20 mg·kg-1·h-1泵注4 h,S組和IR組于該時(shí)間點(diǎn)泵注等體積的生理鹽水,I組泵注等體積的脂質(zhì)溶劑,均持續(xù)4 h。
1.4 改良神經(jīng)功能缺損程度(modified neurological severity score,mNSS)評(píng)分 每組各取 6 只大鼠在術(shù)后 1、3、7、14、21和28 d分別進(jìn)行mNSS評(píng)分,包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡試驗(yàn),測(cè)試方法參考Chen等[5]的方法,得分越高提示神經(jīng)功能損傷越重,0分為正常,18分為最高功能障礙。
1.5 腦梗死體積百分比測(cè)量 在術(shù)后1、7、14和28 d每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取6只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛350 mg·kg-1麻醉后處死取腦,置于-20℃冰箱冷凍30 min后,以2 mm間距連續(xù)冠狀切成6片,棄去嗅球及小腦組織。放入1%TTC溶液中37℃溫箱避光孵育30 min,每隔15 min翻動(dòng)腦片使均勻接觸到染色液,取出腦切片放至10%福爾馬林中固定,24 h后數(shù)碼相機(jī)拍照,輸入計(jì)算機(jī),采用Imageproplus 6.0圖像處理軟件計(jì)算梗死面積(粉紅色區(qū)域?yàn)檎DX組織,白色區(qū)域?yàn)楣K澜M織),各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)即為腦梗死體積,以梗死體積占全腦體積得百分比作為腦梗死體積百分比,其中為代償腦缺血后水腫效應(yīng),腦梗死面積矯正計(jì)算方法如下:矯正后梗死面積=測(cè)量的梗死面積×{1-[(同側(cè)半球面積-對(duì)側(cè)半球面積)/對(duì)側(cè)半球面積]}[6]。
1.6 Morris水迷宮測(cè)試 每組各取6只大鼠于術(shù)后8和22 d開(kāi)始進(jìn)行兩周期的Morris水迷宮測(cè)試,檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。參照Vorhees等[7]的方法,進(jìn)行每周期歷時(shí)5 d的定位航行實(shí)驗(yàn),記錄大鼠逃避潛伏期(escape latency,EL;即從大鼠入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并立于其上所需時(shí)間),用于測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的能力。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)均以±s表示,mNSS評(píng)分、梗死體積百分比及定位航行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),組間兩兩比較采用q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 mNSS評(píng)分 S組無(wú)神經(jīng)功能缺損,各時(shí)間點(diǎn)均為0分。與S組相比,IR組和I組在缺血后多時(shí)間點(diǎn)的mNSS評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),P組評(píng)分隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低,在缺血后28 d與S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IR組與I組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);P組大鼠缺血3 d后的mNSS評(píng)分與IR組比較有明顯的降低(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠mNSS評(píng)分比較 (n=6,分±s)
表1 各組大鼠mNSS評(píng)分比較 (n=6,分±s)
*P<0.05,**P<0.01;表2~4同
組別S組(1)IR組(2)I組(3)P 組(4)F q(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(2)∶(3)(2)∶(4)(3)∶(4)1 d 0 10.50±1.05 10.33±1.03 9.17±1.17 172.20**27.369**26.926**23.903**0.443 3.467 3.024 3 d 0 9.17±0.98 8.67±1.03 6.83±1.33 113.10**23.075**21.817**17.187**1.258 5.888**2.919 7 d 0 7.83±0.75 7.50±1.05 6.00±1.26 97.55**21.269**20.373**16.298**0.896 4.971*4.074*14 d 0 4.83±0.98 5.17±0.75 3.33±1.03 51.45**14.720**15.757**10.149**1.036 4.571*5.608**21 d 0 2.83±0.75 2.50±0.55 1.00±0.63 33.16**12.342**10.903**4.361*1.439 7.981**6.542**28 d 0 2.00±0.63 1.50±0.55 0.50±0.55 20.00**9.789**7.341**2.447 2.447 7.341**4.894*
2.2 腦梗死體積百分比 假手術(shù)組大鼠均未見(jiàn)明顯梗死灶,IR組、I組及P組均出現(xiàn)大小不一的梗死灶;IR組與I組腦梗死體積百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);P組的腦梗死體積百分比較IR組、I組小(P<0.05或P<0.01),P組在28 d與S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖1、表2。
表2 各組大鼠腦梗死體積百分比 (n=6,%±s)
表2 各組大鼠腦梗死體積百分比 (n=6,%±s)
組別S組(1)IR組(2)I組(3)P 組(4)F q(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(2)∶(3)(2)∶(4)(3)∶(4)1 d 0 25.80±0.86 26.23±1.85 17.38±0.75 776.64**58.149**59.118**39.172**0.969 18.977**19.946**7 d 0 16.64±2.57 16.37±1.49 12.96±0.68 159.29**26.752**26.318**20.836**0.434 5.916**5.482**14 d 0 6.60±1.34 7.04±0.82 3.95±1.15 66.19**16.607**17.714**9.939**1.107 6.668**7.775**28 d 0 2.73±0.94 2.68±0.95 1.23±0.79 16.92**8.615**8.457**3.881 0.158 4.733*4.576*
2.3 Morris水迷宮測(cè)試 定位航行實(shí)驗(yàn)中各組大鼠兩周期的EL見(jiàn)表3、4。S組EL較IR及I組縮短(P<0.01),在8~11 d及22 d,P組較 S組 EL延長(zhǎng)(P<0.05和P<0.01),在12 d及23~26 d,P組與 S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);IR組與I組之間EL差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);P組除8和22 d外,EL均較IR組縮短,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。
表 3 各組大鼠8~12 d的EL比較 (n=6,s±s)
表 3 各組大鼠8~12 d的EL比較 (n=6,s±s)
組別S組(1)IR組(2)I組(3)P 組(4)F q(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(2)∶(3)(2)∶(4)(3)∶(4)8 d 75.44±12.68 114.62±10.10 108.34±9.32 100.48±13.01 13.66**8.426**7.075**5.385**1.350 3.041 1.690 9 d 50.70±9.94 95.23±18.45 98.72±13.46 72.92±9.94 16.57**8.135**8.772**4.059*0.638 4.076*4.713*10 d 29.69±9.01 79.78±14.01 67.83±11.37 49.70±8.72 23.78**11.168**8.504**4.462*2.664 6.707**4.042**11 d 18.93±6.52 51.58±13.21 52.42±7.33 35.25±9.49 16.72**8.421**8.637**4.209*0.217 4.211*4.428*12 d 14.90±5.62 35.60±7.58 33.42±6.32 20.04±10.58 10.16**6.534**5.846**1.622 0.688 4.912*4.223*
表 4 各組大鼠22~26 d的EL比較 (n=6,s,±s)
表 4 各組大鼠22~26 d的EL比較 (n=6,s,±s)
組別S組(1)IR組(2)I組(3)P組(4)F q(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(2)∶(3)(2)∶(4)(3)∶(4)22 d 17.57±4.37 33.59±5.70 35.32±6.12 29.48±8.92 9.10**6.02**6.68**4.48*0.65 1.55 2.20 23 d 12.56±2.17 29.47±6.00 27.35±5.32 20.13±8.00 10.61**7.18**6.28**3.22 0.90 3.97*3.07 24 d 10.40±1.94 28.15±6.18 28.76±5.33 18.79±6.73 4.60*8.09**8.36**3.82 0.28 4.26*4.54*25 d 9.44±1.53 26.21±7.30 24.87±4.73 15.35±3.96 16.32**8.488**7.810**3.497 0.678 4.990*4.312*26 d 8.81±1.10 22.86±5.91 20.19±4.33 13.40±3.74 14.25**8.28**7.30**3.30 0.98 4.99*4.00*
參照Longa法制作的大鼠MCAO局灶性腦缺血再灌注模型是研究腦缺血的經(jīng)典模型。在局灶性腦缺血再灌注損傷中,梗死部位多反映在大腦皮質(zhì)及基底節(jié)區(qū),缺血后多伴隨功能性的改變。因此本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和功能學(xué)相結(jié)合的方法評(píng)價(jià)腦損傷狀況,mNSS評(píng)分和梗死體積測(cè)量是評(píng)價(jià)腦缺血再灌注損傷的金指標(biāo)。海馬區(qū)神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧耐受能力較差,腦缺血會(huì)直接或間接引起海馬區(qū)神經(jīng)元的變性壞死,不同程度影響個(gè)體的學(xué)習(xí)及記憶功能[7]。本研究應(yīng)用Morris水迷宮對(duì)大鼠腦缺血損傷后空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行客觀評(píng)價(jià),從另一方面反映大鼠神經(jīng)功能缺損情況。
藥物后處理通過(guò)藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)(如腺苷、緩激肽等),從而發(fā)揮腦保護(hù)作用,以藥物替代缺血刺激,較缺血后處理在臨床上更具有應(yīng)用價(jià)值。靜脈麻醉藥丙泊酚由于能降低腦氧代謝率及顱內(nèi)壓等腦生理藥理學(xué)特性,被認(rèn)為是神經(jīng)外科手術(shù)較為理想的麻醉用藥。筆者前期研究結(jié)果顯示于再灌注血流再通即刻給予丙泊酚10和20 mg·kg-1·h-1后處理30 min對(duì)腦缺血再灌注損傷具有急性期保護(hù)作用,能夠減少腦梗死體積和細(xì)胞凋亡,改善神經(jīng)缺損評(píng)分,20 mg·kg-1·h-1組效果更明顯[3],但其是否具有長(zhǎng)時(shí)程保護(hù)作用的研究尚少見(jiàn)。臨床上應(yīng)用的丙泊酚多以甘油、卵磷脂、大豆油等脂質(zhì)成份作為賦形劑,主要成分為多不飽和脂肪酸,具有促炎癥反應(yīng)和免疫抑制效應(yīng)[8]。
本研究結(jié)果顯示,丙泊酚脂質(zhì)溶劑成分并不參與調(diào)控或介導(dǎo)丙泊酚后處理的長(zhǎng)時(shí)程腦保護(hù)作用,再灌注即刻給予丙泊酚20 mg·kg-1·h-1后處理4 h,從總體上能夠明顯改善mNSS評(píng)分、減小大鼠腦組織梗死體積及改善缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶水平,從形態(tài)和功能兩方面表明丙泊酚后處理具有長(zhǎng)時(shí)程的腦保護(hù)作用,且其保護(hù)時(shí)間窗至少長(zhǎng)達(dá)缺血后28 d,且這種腦保護(hù)作用可能最終通過(guò)縮小腦梗死體積及改善神經(jīng)功能來(lái)實(shí)現(xiàn)。
綜上所述,丙泊酚缺血后處理有一定的長(zhǎng)時(shí)程腦保護(hù)作用,且這種作用可維持至28 d,與脂質(zhì)溶劑成分無(wú)關(guān)。
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