謝甲貝 張慶瑜 康春生 韓 靜 王 濤 張 潔

多數(shù)惡性腫瘤在發(fā)現(xiàn)時(shí)已伴有不同程度的轉(zhuǎn)移，研究其侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制意義重大。蛋白激酶B（PKB或Akt）通路即以絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族為中心的信號(hào)傳導(dǎo)通路，是近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)。作為多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的焦點(diǎn)，其通過(guò)下游通路影響腫瘤細(xì)胞多重生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)包括侵襲和轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程[1-2]。Akt亞型Akt1、Akt2在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用不盡相同，在不同細(xì)胞系中對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移的影響甚至相反[2]。本研究將外源性Akt1、Akt2基因?qū)肴宋葛つど掀ぜ?xì)胞GES-1中，觀察并分析兩者對(duì)GES-1的影響，旨在從其侵襲力和遷移方面探討Akt1、Akt2基因?qū)е抡Ｎ葛つど掀ぜ?xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及質(zhì)粒 GES-1購(gòu)自北京百和營(yíng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。p-LXSN質(zhì)粒及含Akt1和Akt2基因全cDNA序列的p-LXSN-Akt1、p-LXSN-Akt2質(zhì)粒由美國(guó)南佛羅里達(dá)大學(xué)Dr.Jin Q.Cheng惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 質(zhì)粒抽提、純化試劑盒和總蛋白提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，脂質(zhì)體Lipo?fectamineTM2000、DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、抗生素G418購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，兔抗人Akt1、Akt2、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、抗絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）單抗購(gòu)自美國(guó)San?ta Cruz公司，抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（抗GAPDH）單克隆抗體、辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、免疫熒光單克隆抗體FITC標(biāo)記二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Pierce公司（SuperSignal West Pico 34080）；Olympus光學(xué)顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因轉(zhuǎn)染和克隆篩選 人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1體外細(xì)胞株培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為濕潤(rùn)狀態(tài)下37℃，5%CO2。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到60%~70%融合時(shí)，參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染p-LXSN-Akt1（Akt1組）、p-LXSN-Akt2質(zhì)粒（Akt2組），48 h后，換用含400 mg/L G418的完全培養(yǎng)基篩選，3周后選出抗性克隆株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，以正常未轉(zhuǎn)染的GES-1細(xì)胞為對(duì)照組，以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒p-LXSN的細(xì)胞株為空載組。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞培養(yǎng)至約5×107時(shí)，按總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取各組待測(cè)細(xì)胞的總蛋白，并檢測(cè)樣品蛋白濃度。將各組細(xì)胞總蛋白按比例與5倍上樣緩沖液混合，置100℃沸水中煮15 min。取等量蛋白樣品溶液及蛋白Marker上樣進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳，然后將凝膠電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，置于膜封閉液中封閉過(guò)夜。加入一抗為兔抗人Akt1、Akt2、MMP-2 單抗（1∶1 000），二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶1 000）。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。洗膜后GAPDH二次雜交檢測(cè)作為內(nèi)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用12孔Transwell侵襲小室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。上室的聚碳酸酯膜-Matrigel（5 g/L）在37℃聚合后，在上室孔中分別準(zhǔn)確加入各組細(xì)胞1×105個(gè)/孔（無(wú)血清培養(yǎng)基的單細(xì)胞懸液），下室中加入趨化因子600 μL（小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞48 h無(wú)血清的條件培養(yǎng)液），培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后將Transwell上室的附著細(xì)胞用濕棉簽擦去、蘇木精染色，封片后顯微鏡下直接（200倍）觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。每張膜中央部分和周?chē)糠指麟S機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的穿過(guò)8 μm微孔的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞骨架 備帶有滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，每孔接種3×105個(gè)細(xì)胞于4 mL培養(yǎng)液中。24 h后取蓋玻片做如下處理：4%多聚甲醛固定30 min，PBS液洗滌3次，每次10 min，加0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X-100）處理15 min，PBS液洗滌3次，每次5 min；1%胎牛血清封閉40 min；滴加一抗anti-F-actin（1∶100）置濕盒中4℃過(guò)夜（16~24 h），PBS沖洗3次，滴加異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記二抗（1%牛血清白蛋白-磷酸鹽緩沖液BSA-PBS稀釋?zhuān)?7℃濕盒內(nèi)孵育2 h，50%緩沖甘油封固，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以上實(shí)驗(yàn)各組都設(shè)3組平行樣本，使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染Akt1和Akt2基因的GES-1細(xì)胞的篩選 p-LXSN-Akt1、p-LXSN-Akt2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞后，在G418（400 mg/L）作用下大部分細(xì)胞死亡，培養(yǎng)約10 d后可見(jiàn)剩余細(xì)胞成島狀生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)3周的G418抗性篩選，獲得生長(zhǎng)良好的抗性克?。欢Ｎ崔D(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞在10 d左右完全死亡。

2.2 轉(zhuǎn)染Akt1、Akt2基因的GES-1細(xì)胞蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組和空載組相比，Akt1組中Akt1蛋白的表達(dá)水平明顯升高，MMP-2蛋白表達(dá)量同步增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Akt2組中Akt2蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組和空載組亦明顯升高，MMP-2蛋白表達(dá)量亦同步增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組相應(yīng)蛋白表達(dá)量及細(xì)胞穿出微孔數(shù)比較（n=3±s）

表1 各組相應(yīng)蛋白表達(dá)量及細(xì)胞穿出微孔數(shù)比較（n=3±s）

**P<0.01

0.63±0.05 0.59±0.03 0.96±0.04 0.63±0.05 150.325**0.136<0.001 0.780<0.001 0.081<0.001 0.58±0.05 0.62±0.02 0.62±0.03 0.95±0.04 242.903**0.099 0.052<0.001 0.785<0.001<0.001 0.41±0.03 0.39±0.02 0.74±0.02 0.76±0.03 419.010**0.131<0.001<0.001<0.001<0.001 0.090 21.51±3.05 21.74±2.34 61.03±1.53 65.22±3.09 258.207**0.916<0.001<0.001<0.001<0.001 0.083對(duì)照組（1）空載組（2）Akt1組（3）Akt2組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）組別 Akt1 Akt2 MMP-2穿出細(xì)胞數(shù)（個(gè)）

2.3 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Akt1組和Akt2組平均每個(gè)視野穿出微孔細(xì)胞數(shù)分別較對(duì)照組和空載組增加，侵襲能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而對(duì)照組和空載組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2、表1。

2.4 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞骨架 相對(duì)于空載組和對(duì)照組，Akt1組和Akt2組F-actin聚集增加，見(jiàn)圖3。

3 討論

惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是影響患者生活質(zhì)量和死亡的最主要原因。Akt通路與腫瘤發(fā)、生發(fā)展密切相關(guān)，在導(dǎo)致其生長(zhǎng)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，活化的Akt1促進(jìn)人類(lèi)胃癌、胰腺癌、纖維肉瘤和成纖維細(xì)胞的侵襲能力[4]。降低Akt1的表達(dá)后，內(nèi)皮細(xì)胞向基質(zhì)蛋白的黏附及遷移能力明顯降低，Akt1表達(dá)缺失的內(nèi)皮細(xì)胞向纖維蛋白原及玻璃黏連蛋白的黏附能力低于野生型的內(nèi)皮細(xì)胞[5]。Akt2的高表達(dá)和突變不僅在膠質(zhì)瘤組織中可以檢測(cè)到，而且在乳腺癌、大腸癌以及卵巢癌組織中也可以檢測(cè)到。Zhang等[6]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN-229中通過(guò)小干擾RNA（siRNA）技術(shù)下調(diào)Akt2基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)黏附和侵襲能力明顯降低，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論。以上研究均表明Akt的亞型在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移中起到重要作用。

細(xì)胞遷移是細(xì)胞位置改變的動(dòng)態(tài)過(guò)程，它是一種復(fù)雜的細(xì)胞行為，在胚胎發(fā)育、傷口愈合和腫瘤細(xì)胞侵襲等方面發(fā)揮重要作用，且貫穿于腫瘤轉(zhuǎn)移的全過(guò)程。肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架中微絲的主要成分，而細(xì)胞骨架是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它通過(guò)自身結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)重組實(shí)現(xiàn)細(xì)胞遷移，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Qian等[7]研究發(fā)現(xiàn)在雞胚纖維細(xì)胞中活化的Akt形式（Myr-P3k）的足量表達(dá)能通過(guò)下游效應(yīng)分子P70S6K1誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白生成和細(xì)胞遷移。Zhang等[6]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN-229中下調(diào)Akt2后，發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）刺激產(chǎn)生的F-actin聚集減少，蛋白印跡驗(yàn)證MMP-9蛋白表達(dá)降低；Akt2基因可能通過(guò)增加Akt磷酸化增強(qiáng)蛋白（Girdin蛋白）調(diào)控細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞黏附，促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲和遷移。上述研究都說(shuō)明Akt亞型通過(guò)下游信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞遷移能力。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，Akt的2個(gè)亞型在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用比較復(fù)雜。研究表明，Akt1過(guò)表達(dá)可以抑制多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系的侵襲性遷移，而應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默Akt1表達(dá)后卻導(dǎo)致了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而加劇腫瘤的轉(zhuǎn)移[8]。相反，在不同乳腺癌細(xì)胞系用siRNA技術(shù)下調(diào)Akt2的表達(dá)均抑制了細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)和腫瘤的轉(zhuǎn)移[9]。而胰腺癌細(xì)胞中Akt1和Akt2均通過(guò)上調(diào)胰島素樣生長(zhǎng)因子-I（IGF-I）受體促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[10]?；?Akt1，Akt2基因表達(dá)與GES-1細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移的作用機(jī)制尚未明了，本研究采用脂質(zhì)體法分別將含Akt1和Akt2基因全長(zhǎng)cDNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞，成功地建立了穩(wěn)定表達(dá)Akt1及Akt2蛋白的GES-1細(xì)胞。Transwell法分析表明轉(zhuǎn)染Akt1和Akt2基因的GES-1細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，蛋白印跡顯示MMP-2表達(dá)均相應(yīng)升高。免疫熒光示轉(zhuǎn)染Akt1和Akt2基因后細(xì)胞骨架F-actin聚集增加，從側(cè)面反映了細(xì)胞向惡性方面轉(zhuǎn)化。然而，Akt1、和Akt2基因在某些細(xì)胞系中（如胰腺癌細(xì)胞系）作用一致，在某些細(xì)胞系中（如乳腺癌細(xì)胞系）作用相反，這可能與Akt亞型的功能不同及細(xì)胞特異性有關(guān)，也可能與不同細(xì)胞類(lèi)型信號(hào)傳導(dǎo)通路異同有關(guān)，需要進(jìn)一步研究探討，期待為抑制GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的新方法。

[1]Brazil DP,Park J,Hemmings BA.PKB binding proteins.Getting in on the Akt[J].Cell,2002,111(3):293-303.

[2]Toker A,Yoeli-Lerner M.Akt signaling and cancer:surviving but not moving on[J].Cancer Res,2006,66(8):3963-3966.

[3]Samuels Y,Ericson K.Oncogenic PI3K and its role in cancer[J].Curr Opin Oncol,2006,18(1):77-82.

[4]Chin YR,Toker A.Function of Akt/PKB signaling to cell motility,in vasion and the tumor stroma in cancer[J].Cell Signal,2009,21(4):470-476.

[5]Somanath PR,Kandel ES,Hay N,et al.AKT1 signaling regulates inte?grin activation,matrix recognition and fibronectin assembly[J].J Biol Chem,2007,282(31):22964-22976.

[6]Zhang B,Gu F,She C.Reduction of Akt2 inhibits migration and inva?sion of glioma cells[J].Int J Cancer,2009,125(3):585-595.

[7]Qian Y,Corum L,Meng Q,et al.PI3K induced actin filament remod?eling through Akt and p70S6K1:implication of essential role in cell migration[J].Am J Physiol Cell Physiol,2004,286(1):C153-C163.

[8]Zhou GL,Tucker DF,Bae SS,et al.Opposing roles for Akt1 and Akt2 in Rac/Pak signaling and cell migration[J].J Biol Chem,2006,281(47):36443-36453.

[9]Wang J,Wan W,Sun R,et al.Reduction of Akt2 expression inhibits chemotaxis signal transduction in human breast cancer cells[J].Cell Signal,2008,20(6):1025-1034.

[10]Tanno S,Tanno S,Mitsuuchi Y,et al.AKT activation up-regulates in?sulin-like growth factor I receptor expression and promotes inva?siveness of human pancreatic cancer cells[J].Cancer Res,2001,61(2):589-593.