王會(huì)妍 糜若然 張?jiān)粕?/p>

超排卵技術(shù)是提高體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）妊娠率的方法之一，然而不同個(gè)體的卵巢對(duì)外源性促性腺激素（gonadotropin，Gn）反應(yīng)不同，卵巢低反應(yīng)以超排卵后獲卵數(shù)目少和血雌二醇（E2）峰值低為特征，發(fā)生率約為12%~30%[1]，易導(dǎo)致治療周期取消和低妊娠率，是體外受精（IVF）中的難題。生長(zhǎng)分化因子（growth differentiation factor，GDF）-9作為卵源性生長(zhǎng)因子，通過自分泌及旁分泌機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育及卵巢功能，調(diào)控優(yōu)勢(shì)卵泡的形成及穩(wěn)定卵母細(xì)胞微環(huán)境有重要作用。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR）技術(shù)檢測(cè)不孕癥患者超排卵周期卵泡顆粒細(xì)胞GDF-9的表達(dá)情況，旨在探討GDF-9與卵巢低反應(yīng)的關(guān)系，以期提高獲卵率。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選 取2009年5月—2010年1月因男性因素不孕就診于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的女性患者70例，平均年齡（30.62±4.67）歲，標(biāo)本均獲得患者知情同意后采集。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡<40歲，基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）<10 IU/L，催乳素正常范圍，月經(jīng)周期規(guī)律，近3個(gè)月內(nèi)未接受過促排卵治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、甲狀腺功能異常及卵巢手術(shù)史者。

1.2 方法

1.2.1 超排卵方案及分組 采用常規(guī)長(zhǎng)方案控制性超排卵，于前次月經(jīng)周期基礎(chǔ)體溫上升后第7天，即黃體高峰期開始應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa），皮下注射曲普瑞林注射液0.05 mg/d，下一月經(jīng)周期第3~5天據(jù)患者年齡和B超提示卵巢體積、竇狀卵泡數(shù)肌注Gn，包括重組卵泡刺激素（rFSH，商品名：果納芬）和尿促性腺素（HMG），于周期第8天起行陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，據(jù)E2水平及陰道超聲觀察卵泡發(fā)育情況調(diào)整劑量，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡平均直徑達(dá)18 mm或有3個(gè)卵泡平均直徑達(dá)16 mm時(shí)停用，當(dāng)晚肌注絨毛膜促性腺素（HCG），36 h后陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。依據(jù)取卵時(shí)獲得平均直徑>14 mm的卵泡數(shù)目進(jìn)行分組[2]：卵泡數(shù)≤5個(gè)為卵巢低反應(yīng)組，6~19個(gè)為中反應(yīng)組，≥20個(gè)為高反應(yīng)組。

1.2.2 標(biāo)本采集 留取患者卵泡穿刺液經(jīng)2 000 r/min離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀物用PBS配成懸液，以1∶1的比例將細(xì)胞懸液緩慢加入到percoll分離液上，以2 000 r/min離心20 min，吸取顆粒細(xì)胞層，含有少量紅細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液洗滌、溶解紅細(xì)胞。然后經(jīng)PBS洗滌去除紅細(xì)胞裂解液。并于取卵后4 h解剖顯微鏡下留取MⅡ期卵母細(xì)胞的卵丘顆粒細(xì)胞，吹打分散細(xì)胞團(tuán)，2 000 r/min離心10 min，經(jīng)PBS洗滌。獲得的卵泡壁顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞最后均加入Trizol分別置1.5 mL EP管中，經(jīng)液氮快速冷凍后于-80℃冰箱備用。

1.2.3 Real-time PCR 顆粒細(xì)胞總RNA提取依據(jù)Trizol法操作，取總RNA 2 μg逆轉(zhuǎn)錄（RT），取 2 μL RT 產(chǎn)物使用Roche Light Cycler定量PCR儀，進(jìn)行Real-time PCR（SYBR Green熒光染料購(gòu)自TOYOBO公司），目的基因GDF-9引物序列為：上游5′-CAGGCTCCTGGAGACCAGGTAA-3′；下游5′-TT GCACACACATTTGACAGCAGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為158 bp。以GAPDH為內(nèi)參，其上、下游引物序列分別為：5′-CCAG CAAGAGCACAAGAGGAA-3′，5′-GGTTGAGCACAGGGTACTT TATT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為181 bp。總反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 1 0 s，58℃ 1 0 s，72℃ 1 0 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳無引物二聚體和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)積累量，得到各管標(biāo)本的擴(kuò)增曲線及目的序列的Ct值，同時(shí)檢測(cè)該管標(biāo)本管家基因GAPDH的Ct值，計(jì)算各管標(biāo)本待測(cè)序列的△Ct值（△Ct=目的序列的Ct值-該管樣品GAPDH的Ct值），該管標(biāo)本目的序列的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔCt值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q法分析，兩變量間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢不同反應(yīng)組患者臨床資料比較 70例IVF患者中卵巢低反應(yīng)組21例，中反應(yīng)組25例，高反應(yīng)組24例；各組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、E2水平、Gn用量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見表1。

表1 卵巢低、中、高反應(yīng)組間臨床資料比較 （±s）

表1 卵巢低、中、高反應(yīng)組間臨床資料比較 （±s）

均P>0.05

低反應(yīng)組中反應(yīng)組高反應(yīng)組F 21 25 24年齡（歲）31.86±5.33 30.42±4.79 30.25±5.15 1.126不孕年限（a）4.30±2.69 4.85±3.01 4.55±2.83 0.947 FSH（IU/L）5.59±1.49 6.03±1.62 5.42±1.94 0.873 E2（nmol/L）78.55±32.64 80.61±38.70 76.16±37.38 1.009 Gn用量（IU）2 330.3±688.5 2 211.8±677.3 2 173.5±752.3 1.107組別 n

2.2 卵巢不同反應(yīng)組顆粒細(xì)胞GDF-9基因表達(dá)情況 在患者卵泡壁顆粒細(xì)胞及卵丘顆粒細(xì)胞中均有GDF-9 mRNA表達(dá)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低反應(yīng)組卵泡壁顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞的GDF-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于中反應(yīng)組及高反應(yīng)組（均P<0.05），見表2。

2.3 GDF-9表達(dá)與超排卵獲卵數(shù)的相關(guān)性 卵巢低、中、高反應(yīng)組的獲卵數(shù)分別為：（3.43±0.98）、（12.21±3.59）、（24.95±5.94）個(gè)。卵泡壁顆粒細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞GDF-9 mRNA表達(dá)量與超排卵獲卵數(shù)呈正相關(guān)（r分別為0.508、0.632，均P<0.01）。

表2 卵巢低、中、高反應(yīng)組GDF-9 mRNA表達(dá)情況（±s）

表2 卵巢低、中、高反應(yīng)組GDF-9 mRNA表達(dá)情況（±s）

*P<0.05，**P<0.01

低反應(yīng)組（1）中反應(yīng)組（2）高反應(yīng)組（3）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）21 25 24卵泡壁顆粒細(xì)胞表達(dá)量（×104）18.64±8.35 23.68±6.27 32.75±13.98 4.551*3.590*4.819**3.051*卵丘顆粒細(xì)胞表達(dá)量（×104）19.29±9.32 26.44±12.17 38.06±14.28 4.742*2.994*6.752**3.698*組別 n

3 討論

GDF-9屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族，是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的卵母細(xì)胞來源的生長(zhǎng)因子[3]，其基因定位于人染色體5q31.1，包含2個(gè)外顯子及1.6 kb的內(nèi)含子。GDF-9具有促進(jìn)卵泡募集和增加排卵率的作用，并通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的功能，參與調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)的微環(huán)境。

GDF-9和FSH都能刺激卵泡的發(fā)育，GDF-9主要作用于原始和初級(jí)卵泡，而FSH主要促進(jìn)次級(jí)卵泡及以后階段的卵泡發(fā)育。GDF-9的重要靶細(xì)胞是顆粒細(xì)胞，其可刺激顆粒細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)竇前卵泡的發(fā)育，亦能調(diào)節(jié)FSH在顆粒細(xì)胞中的作用[4]。本研究應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)IVF-ET患者超排卵周期顆粒細(xì)胞GDF-9 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示GDF-9 mRNA在超排卵患者的卵泡壁顆粒細(xì)胞及卵丘顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)水平與卵巢低反應(yīng)程度有關(guān)。卵巢低反應(yīng)患者GDF-9 mRNA表達(dá)量低，卵泡發(fā)育少；而高反應(yīng)患者GDF-9表達(dá)量高，獲卵數(shù)多，二者呈正相關(guān)關(guān)系，證實(shí)了GDF-9的表達(dá)對(duì)卵泡發(fā)育起重要作用。Kobayashi等[5]發(fā)現(xiàn)GDF-9反義核苷酸可降低FSH受體的mRNA水平，抑制了基礎(chǔ)狀態(tài)（無FSH）和FSH刺激下的竇前卵泡生長(zhǎng)，而該抑制作用可被外源性GDF-9拮抗，加入GDF-9后卵泡的發(fā)育數(shù)增加。GDF-9通過調(diào)節(jié)FSH受體與G蛋白的偶聯(lián)和FSH受體水平來調(diào)控FSH的作用，抑制FSH誘導(dǎo)產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷（cAMP），從而影響卵泡發(fā)育。對(duì)倉(cāng)鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FSH可上調(diào)GDF-9的表達(dá)，該作用可被GDF-9的小干擾RNA（siRNA）完全抑制[6]。以上研究提示，足量的GDF-9是FSH調(diào)控卵泡發(fā)育必需的，且FSH受體的mRNA表達(dá)亦需要足夠的GDF-9，GDF-9表達(dá)降低或是缺陷可能導(dǎo)致FSH受體異常，對(duì)FSH反應(yīng)降低，影響竇前期和早竇期的卵泡生存與生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致超排卵周期的卵巢低反應(yīng)。

Mottershead等[7]報(bào)道人原始卵泡在無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后，重組GDF-9處理的原始卵泡有53%達(dá)到初級(jí)階段，而不存在重組GDF-9條件下的對(duì)照組只有31%達(dá)到初級(jí)階段，并且用GDF-9處理的卵泡成活力也明顯提高。應(yīng)用重組GDF-9能增加初級(jí)卵泡的數(shù)量，減少卵泡的閉鎖，并抑制FSH引起的黃體生成素（LH）受體、E2、孕酮黃體酮（P4）的生物合成，GDF-9能通過顆粒細(xì)胞，刺激抑制素的產(chǎn)生、抑制素亞單元mRNA的表達(dá)和抑制素a啟動(dòng)子的活性。GDF-9可促進(jìn)FSH非依賴期的卵泡生長(zhǎng)，在FSH依賴期與FSH協(xié)同作用，刺激卵泡生長(zhǎng)及抑制卵泡過早黃素化。GDF-9能極大地影響FSH的作用，因此卵巢內(nèi)GDF-9與Gn相互作用對(duì)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控已成為近年研究的熱點(diǎn)。

GDF-9是卵泡發(fā)育過程中不可或缺的生長(zhǎng)因子，本研究發(fā)現(xiàn)其mRNA表達(dá)水平降低與IVF超排卵周期卵巢低反應(yīng)有關(guān)。對(duì)于超排卵反應(yīng)低下的患者，可嘗試應(yīng)用重組GDF-9刺激初級(jí)卵泡生長(zhǎng)，增加對(duì)Gn敏感的竇前卵泡，與rFSH協(xié)同調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育，改善卵巢功能。可以減少Gn的用量，使得促排卵方案更加合理，為不孕癥患者利用自身卵母細(xì)胞提供可能性，為治療卵巢低反應(yīng)提供新方法。

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