黃婷婷，王紅亮，唐剛?cè)A

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)PET－CT中心，廣東 廣州 510080）

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是細(xì)胞生命的基本特征之一。對活體內(nèi)細(xì)胞凋亡進(jìn)行分子顯像對于疾病治療效果評估、治療進(jìn)程的監(jiān)測、以及某些疾病的早期診斷或研究新療法具有非常重要意義。正電子發(fā)射斷層顯像（PET）作為近年來新興的無創(chuàng)性功能性顯像手段，是最前沿、最先進(jìn)的分子影像學(xué)技術(shù)，研發(fā)細(xì)胞凋亡PET探針是實現(xiàn)活體內(nèi)細(xì)胞凋亡PET顯像的前提條件。臨床上細(xì)胞凋亡顯像劑研究最初主要集中于大分子蛋白質(zhì)探針，鑒于大分子蛋白質(zhì)探針的局限性，研發(fā)細(xì)胞凋亡小分子PET探針具有非常重要的臨床價值。

1 細(xì)胞凋亡與PET分子顯像

1.1 細(xì)胞凋亡

最早在1972年，Kerr、Wyllie和 Currie等［1］3位科學(xué)家共同提出了“細(xì)胞凋亡（Apoptosis）”的概念。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的兩個主要形式，兩者的不同主要在于細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的變化，前者的典型形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)為凋亡早期細(xì)胞體縮小、胞漿量減少、核染色質(zhì)濃縮、核仁裂解，繼之細(xì)胞膜內(nèi)陷，胞體自行分割成許多由膜包裹的結(jié)構(gòu)完整的超微細(xì)胞體（稱為凋亡小體，Apoptotic Body），最后凋亡小體被鄰近組織識別、吞噬或自行脫落，離開生物體，這是一種主動的、程序化的細(xì)胞死亡過程。而細(xì)胞壞死的細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞，是無基因調(diào)控、不耗能的被動的細(xì)胞死亡過程。

細(xì)胞凋亡是多種基因調(diào)控的細(xì)胞程序化死亡過程，具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制，可見于胚胎發(fā)育、組織發(fā)生、組織分化、免疫調(diào)節(jié)等諸多生理過程和惡性腫瘤、心肌梗塞、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、艾滋病等多種病理情況［2］。細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞固有的生理過程，并受遺傳調(diào)控蛋白系統(tǒng)的嚴(yán)格制衡，無論生理性的或與疾病相關(guān)的細(xì)胞變化都可能觸發(fā)凋亡程序，最終導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入死亡過程。細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要經(jīng)過兩種途徑［3］：①內(nèi)源性途徑，即線粒體途徑，線粒體通透性的改變，細(xì)胞膜不可逆性的去極化，細(xì)胞色素C的釋放，蛋白凋亡酶Caspase的激活；②外源性途徑，即死亡受體途徑，死亡受體及配體（如腫瘤壞死因子、介導(dǎo)凋亡配體相關(guān)的腫瘤壞死因子和Fas配體等）的跨膜和誘發(fā)Caspase激活信號的傳導(dǎo)。細(xì)胞凋亡程序通過內(nèi)源或外源性途徑啟動之后，凋亡細(xì)胞自身會產(chǎn)生一系列的病理生理改變。在這一過程中凋亡細(xì)胞將產(chǎn)生（或暴露、結(jié)合）多種可識別的、特異性的化學(xué)信號（靶標(biāo)），通過正電子核素標(biāo)記配體與凋亡細(xì)胞中特異靶標(biāo)結(jié)合的特性即可進(jìn)行細(xì)胞凋亡PET分子顯像。

1.2 細(xì)胞凋亡PET顯像的優(yōu)勢

目前，已有多種實驗室技術(shù)（如形態(tài)學(xué)方法和細(xì)胞分子生物學(xué)方法等）用于檢測細(xì)胞凋亡，這些方法屬于體外研究方法，對活體器官、組織具有創(chuàng)傷性，且通常只能在某一特定時間點進(jìn)行研究，不能連續(xù)、動態(tài)檢測和監(jiān)測細(xì)胞凋亡現(xiàn)象在活體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展的全過程，同時受到多種因素的影響。利用無創(chuàng)傷性分子影像學(xué)技術(shù)，如光學(xué)成像、磁共振成像（MRI）、核醫(yī)學(xué)成像技術(shù)及超聲（US）成像等，用熒光素、順磁性物質(zhì)、放射性核素及微泡等報告要素標(biāo)記AnnexinⅤ作為顯像劑，檢測活體細(xì)胞凋亡，是很有前景的分子顯像方法。然而，MRI和US由于靈敏度較低，光學(xué)成像技術(shù)由于穿透力和斷層分辨率較低，其應(yīng)用受到一定程度的限制。單光子發(fā)射計算機(jī)斷層成像（SPECT）由于具有較低分辨率，其應(yīng)用也受到一定限制。PET技術(shù)在腫瘤學(xué)、神經(jīng)精神病學(xué)和心臟病學(xué)中的應(yīng)用價值已得到人們認(rèn)可，并顯示出巨大應(yīng)用前景。與其他分子影像學(xué)技術(shù)（如SPECT）相比，PET具有高靈敏度和合適的斷層分辨率、標(biāo)記藥物半衰期短且不改變原藥物的藥理活性等顯著優(yōu)點，通過與X線計算機(jī)斷層（CT）顯像同機(jī)融合后，PET顯像更趨完善，無創(chuàng)傷性的PET顯像可望成為活體內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡的最佳技術(shù)。

1.3 細(xì)胞凋亡大分子PET探針的局限性

AnnexinⅤ是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能夠?qū)Ｒ恍缘亟Y(jié)合暴露在細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidyl Serine，PS）。99Tcm標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白（99Tcm－Annexin Ⅴ）是第一個用于臨床的細(xì)胞凋亡放射性顯像劑，臨床研究［4］證實：99Tcm－AnnexinⅤ作為顯像劑在心血管疾病如心肌梗塞、粥樣硬化斑塊中的細(xì)胞凋亡檢測，多種腫瘤（如頭頸部腫瘤）的療效評價和預(yù)后判斷等方面具有一定優(yōu)勢。然而，由于AnnexinⅤ相對分子質(zhì)量較大（3.6×104），導(dǎo)致血液清除較慢，信噪比（SNR）低，早期顯像效果不佳，以及制備成本高，結(jié)合特異性差和具有免疫原性等缺點［5］，阻礙了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。另外，正電 子 核 素 標(biāo) 記 的 Annexin Ⅴ （18F－AnnexinⅤ）雖可改善其某些藥代動力學(xué)特性，但仍不能克服其大分子蛋白質(zhì)的缺陷，且其放射性標(biāo)記較復(fù)雜，在臨床上的應(yīng)用并不理想［6，7］。其他半衰期較長的正電子核素（如64Cu［8］、124I［9］等）標(biāo)記的AnnexinⅤ也有報道，但仍處于實驗研究階段，尚無臨床研究報道。

2 細(xì)胞凋亡小分子PET探針及其應(yīng)用

理論上，與大分子蛋白質(zhì)相比，相對分子質(zhì)量小的化合物作為PET顯像劑更有優(yōu)勢［10］，主要表現(xiàn)在小分子PET探針放射性核素標(biāo)記相對簡單易行，而且具有更合適的體內(nèi)生物分布和清除率，不易引起免疫反應(yīng)，同時可以通過結(jié)構(gòu)修飾得到應(yīng)用性能更優(yōu)化的PET分子探針。細(xì)胞凋亡過程中除了外翻PS作為AnnexinⅤ的作用靶點之外，其他的形態(tài)學(xué)變化或生物學(xué)變化都可以作為研究細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志，例如活化的Caspase酶、線粒體膜電位耗散和細(xì)胞膜印跡等，并提供了更多可用于檢測細(xì)胞凋亡的作用靶點。目前研究比較多的細(xì)胞凋亡小分子PET顯像劑主要有：Caspase酶小分子抑制劑類探針、Aposense分子類探針、靶向線粒體膜電位下降的陽離子類探針［11］以及靶向PS小分子類探針，其各自的代表結(jié)構(gòu)式示于圖1。

圖1 細(xì)胞凋亡小分子PET顯像劑的相關(guān)結(jié)構(gòu)式

2.1 靶向Caspase PET顯像劑

細(xì)胞在實現(xiàn)凋亡的兩種途徑中最后都導(dǎo)致Caspase－3的活化，進(jìn)而激活內(nèi)切核酸酶，使DNA鏈斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體。因此，激活的Caspase酶可作為檢測細(xì)胞凋亡的一個重要靶點。研究初期主要集中在尋求基于多肽類的配體，后來發(fā)現(xiàn)靛紅磺胺基類的小分子化合物是一類有效的Caspase抑制劑。通過使用核素標(biāo)記的Caspase小分子抑制劑靶向結(jié)合Caspase，活體內(nèi)對凋亡細(xì)胞進(jìn)行PET顯像，包括化 合 物18F－ICMT－11、18F－WC－Ⅱ－89、11C－WC－98 和18F－WC－Ⅳ－3［12－17］。 這 些 分 子 探 針 與Caspase－3具有較高的親和力，動物實驗表明，在環(huán)己酰亞胺或抗Fas抗體介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡模型中肝部放射性攝取明顯增高，經(jīng)過組織學(xué)檢查也進(jìn)一步證實了肝細(xì)胞發(fā)生了凋亡。但是體內(nèi)外的抑制性實驗［17］表明，在加入靛紅類化合物作為抑制劑后，放射性攝取未明顯降低，同時其生物分布特性較差，這些可能與靛紅類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有聯(lián)二羰基的結(jié)構(gòu)有關(guān)。盡管該結(jié)構(gòu)是與Caspase中半胱氨酸的親核性巰基結(jié)合的必需基團(tuán)，但是該結(jié)構(gòu)也使其易與其他含有胺基和巰基基團(tuán)的化合物結(jié)合，從而導(dǎo)致了該類化合物與其他半胱氨酸蛋白酶（如組織蛋白酶）物質(zhì)的非特異結(jié)合。鑒于Caspases在細(xì)胞凋亡過程中的重要作用，用靶向結(jié)合激活的Caspase檢測細(xì)胞凋亡是一種很有效方法，通過進(jìn)一步優(yōu)化其分子結(jié)構(gòu)和改善其應(yīng)用特性，很有可能進(jìn)入到臨床研究。

2.2 線粒體膜去電勢化的PET顯像劑

近來研究表明，細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)不在細(xì)胞核，而在細(xì)胞質(zhì)。在凋亡細(xì)胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生特征性形態(tài)改變和DNA降解之前，線粒體膜功能發(fā)生改變，內(nèi)膜跨膜電位消失和線粒體內(nèi)蛋白酶活化物的釋放，激發(fā)了各種與凋亡相關(guān)的代謝變化。因此，在細(xì)胞凋亡初期，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志之一［18］。凋亡因子一旦從線粒體基質(zhì)傳至細(xì)胞質(zhì)后，細(xì)胞膜通透性增加，從而導(dǎo)致線粒體膜電位下降［19］。18F－氟苯三苯基磷陽離子（18F－FBnTP）是一種對電位敏感的陽離子PET探針，能夠感應(yīng)到凋亡細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降。在正常細(xì)胞內(nèi)線粒體膜內(nèi)的電化學(xué)質(zhì)子梯度能夠促進(jìn)該陽離子探針進(jìn)入線粒體基質(zhì)，而在細(xì)胞凋亡早期，該質(zhì)子梯度消失，使得進(jìn)入線粒體內(nèi)的陽離子探針的量減少，造成攝取信號降低。在體外用星孢菌素處理過的肺癌細(xì)胞［20］、紫杉醇處理過的乳腺癌細(xì)胞［21］和在體內(nèi)用多烯紫杉醇處理過的荷前列腺癌［22］小鼠模型實驗均證實，癌細(xì)胞攝取18F－FBnTP明顯減低。通過檢測線粒體膜電位勢能耗損的方法研究細(xì)胞凋亡具有一定的局限性。這是由于該方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化，例如細(xì)胞內(nèi)耐藥性蛋白質(zhì)作用也會造成這類陽離子探針的外流，會使一些正常細(xì)胞誤判為凋亡細(xì)胞［20，21］，因而需要進(jìn)一步優(yōu)化該類分子探針的性能。

2.3 靶向凋亡細(xì)胞膜印跡的PET顯像劑

凋亡細(xì)胞膜印跡是指發(fā)生于凋亡早期細(xì)胞的復(fù)雜改變。這種印跡包含了質(zhì)膜勢能不可逆缺失、外質(zhì)膜小葉和細(xì)胞液的永久酸化、以及細(xì)胞膜磷脂化爬行酶系統(tǒng)的活化，然而細(xì)胞膜完整性得以保存。針對此生物性能，研究人員已成功合成了一系列新穎的小分子探針Aposense化合物（如DDC、ML－10、ML－9、NST－732和 NST－729），用于探測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的各種細(xì)胞變化，包括凋亡爬行酶的活化、細(xì)胞膜不可逆去極化和細(xì)胞內(nèi)液的酸化等［23］。這些化合物已用于抗癌物質(zhì)介 導(dǎo)凋亡的腫瘤模型［23－25］、腎衰 模型［26］和缺血性大腦卒中的神經(jīng)血管凋亡［5］等顯像。Zeng等［27］通過使用18F 標(biāo)記的 Aposense化合物NST－732，進(jìn)一步證實了該類化合物能夠用于檢測化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。可區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞的18F標(biāo)記烷基丙二酸衍生物（18FML－10）是Aposense家族中一種結(jié)構(gòu)簡單的化合物（相對分子質(zhì)量為206）［22］，可在凋亡細(xì)胞內(nèi)選擇性濃聚，這與凋亡細(xì)胞中線粒體膜勢能的消失、Caspase激活、以及凋亡DNA片段化相關(guān)。Reshef等［28］利用18F－ML－10在腦中風(fēng)的活體模型進(jìn)行PET顯像，PET顯像清楚顯示了在缺血的腦半球攝取明顯增加，在對側(cè)則相反。18FML－10的生物分布顯示：示蹤劑集中在梗塞區(qū)域；感興趣區(qū)分析顯示，缺血區(qū)放射性濃聚程度是對側(cè)的6～10倍，而且18F－ML－10攝取與組織病理學(xué)具有很好的相關(guān)性。18F－ML－10是首個進(jìn)入臨床階段探測細(xì)胞凋亡的PET小分子示蹤劑，目前在數(shù)個小規(guī)模的臨床試驗中都表現(xiàn)出較好的應(yīng)用效果。在臨床Ⅰ期試驗［29］中，在健康志愿者體內(nèi)18F－ML－10表現(xiàn)了的高穩(wěn)定性、適宜的生物分布和劑量濃度。

2.4 靶向PS小分子PET顯像劑

細(xì)胞凋亡早期，由于細(xì)胞內(nèi)Ca2＋水平增加，使處于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞外側(cè)，外翻的PS是研究細(xì)胞凋亡重要的靶點之一［23，30］。目前一些靶向PS的小分子化合物逐漸被開發(fā)，其中最有應(yīng)用前景的是二（2，2’－二吡啶甲基胺）－Zn2＋類配合物（bis（Zn2＋－2，2｀－dipicolylamine），Zn2＋－DPA），它屬于依賴 Zn2＋型小分 子 化 合 物［31，32］。 含 有 報 告 要 素 熒 光 素 的Zn2＋－DPA配位物已用于體外細(xì)胞凋亡實驗和體內(nèi) 動 物 腫 瘤 的 光 學(xué) 顯 像 研 究［33，34］。Tang等［35］通過 N－烷基化反應(yīng)，引入正電子核素18F標(biāo)記的氟乙基，實現(xiàn)了Zn2＋－DPA配位物的放射性標(biāo)記。另外，通過使用18F－SFB得到放化收率更高的18F標(biāo)記的Zn2＋－DPA配位物，初步的動物實驗［35］表明：該類化合物較AnnexinⅤ具有更好的藥代動力學(xué)特征，荷瘤小鼠經(jīng)過藥物治療后，18F－FB－DPAZn2＋在腫瘤部位放射性攝取明顯增加，且藥物治療前后，18F－FDG在腫瘤部位的放射性攝取沒有明顯變化。因此，正電子核素標(biāo)記的Zn2＋－DPA類化合物，對于活體內(nèi)顯像細(xì)胞凋亡和腫瘤藥物的療效評價具有一定的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)語與展望

綜上所述，從靶向PS的AnnexinⅤ為代表的蛋白類大分子探針，到探測細(xì)胞凋亡過程中多個級聯(lián)反應(yīng)中的小分子探針，說明研發(fā)新的細(xì)胞凋亡小分子PET顯像劑將是細(xì)胞凋亡分子顯像領(lǐng)域重要的發(fā)展方向。小分子PET探針今后幾年的發(fā)展方向主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

1）靶向PS的小分子PET探針是研究的熱點之一，具有很大發(fā)展?jié)摿?，目前靶向PS的小分子PET探針除本研究團(tuán)隊的報道外，尚未發(fā)現(xiàn)其他研究報道，靶向PS的小分子PET探針是細(xì)胞凋亡小分子PET顯像的重要發(fā)展方向。

2）能區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的小分子PET顯像劑的研制，也是細(xì)胞凋亡研究的熱點領(lǐng)域。盡管目前已有可區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的小分子PET顯像劑用于臨床的研究報道，但其在臨床中的實用性有待于進(jìn)一步研究。

3）針對細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)的其他靶點分子，研制新型細(xì)胞凋亡小分子PET顯像劑，也是細(xì)胞凋亡小分子PET顯像的重要發(fā)展方向。

此外，對于臨床上如何準(zhǔn)確評價抗腫瘤藥物治療效果的問題，一直是抗腫瘤治療研究的熱點領(lǐng)域。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為細(xì)胞凋亡顯像能夠準(zhǔn)確評價抗腫瘤治療效果，但是抗腫瘤治療在導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的同時，也伴隨著細(xì)胞壞死［30］。判斷細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡能更準(zhǔn)確評價腫瘤治療效果，這是臨床上必須解決的難點問題。

總之，開發(fā)能最大限度涵蓋細(xì)胞凋亡途徑和非凋亡途徑的多個作用靶點的新型小分子細(xì)胞凋亡PET顯像劑是今后發(fā)展的重要方向。

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