張錦明,徐志紅,張曉軍,向曉輝,田嘉禾

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,北京 100853;2.江常熟蘇華益化工有限公司,江蘇 常熟 215522;3.北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所,北京 100191)

目前11C標(biāo)記的卡芬肽尼(11C-carfentanil,11C-CFN)是唯一用于人體的μ受體顯像類藥物,它對μ受體有很高的親和性和選擇性(與κ和δ受體親和性低)[1],但CFN的生理效應(yīng)很強(qiáng),其藥理作用是嗎啡的 10 000倍[2],因此對11C-CFN的比活度要求很高,以減少載體對人體的藥理作用。11C藥物的比活度除與碘代甲烷的比活度有關(guān)外,與合成速度也相關(guān),合成速度快,最終產(chǎn)品放射性活度高,比活度也高。目前尚無專一合成11C-CFN的模塊,多采用手動或修改商品化模塊程序合成11C-CFN。Dannals RF等[3]最先報道了用11CH3I與去甲基的鈉鹽前體加熱反應(yīng)合成11C-CFN,產(chǎn)品需經(jīng)HPLC純化,盡管起始比活度較高,但合成時間長達(dá)30 min,合成結(jié)束時比活度為1.07×1014Bq/g。Jew ett[4]采用固相萃取方法,選用活性更高的11C-CH 3-triflate與前體反應(yīng),合成時間縮短到20 m in,比活度可達(dá)3.3×1014Bq/g。Shao等[5]修改了商業(yè)多功能碳模塊的程序,自動化合成了11C-CFN,但沒有測量比活度。本研究擬比較LOOP法和反應(yīng)瓶法兩種合成方法,采用國產(chǎn)的膽堿模塊,優(yōu)化合成參數(shù),自動化合成11C-CFN,并用Micro PET/CT顯像證實其在腦內(nèi)的分布特征。

1 主要實驗材料

1mol/L氫化鋰鋁和前體4-哌啶乙酸,4-[(1-丙羰基)苯胺]-1-(2-苯乙基)[游離酸]:德國ABX公司提供;DMSO:A lfa Aesar公司產(chǎn)品;DMF、57%的氫碘酸、1mol/L四丁基胺甲醇溶液:Sigma-A ldrich公司產(chǎn)品;無水乙醇:美國Millennium公司產(chǎn)品,氨水:北京化工廠產(chǎn)品。CFN標(biāo)準(zhǔn)品和前體4-哌啶乙酸鈉,4-[(1-丙羰基)苯胺]-1-(2-苯乙基)[鈉鹽]:自制[6]。

Sep-Pak C-2柱:美國 A lltech公司產(chǎn)品;Sumitomo HM-20S回旋加速器:日本駐友公司產(chǎn)品;11C-碘代甲烷合成器和11C-多功能合成儀:北京派特生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;高效 HPLC分析儀:美國Waters公司產(chǎn)品,配515泵,2487紫外檢測器和BioScan流動放射性檢測器。LC/MS/MS、API2000:美國 API公司產(chǎn)品。eXPlore V ista Micro PET/CT成像系統(tǒng):美國GE公司產(chǎn)品。

SD大鼠:1只,230 g,SPF級,由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動物所提供。

2 實驗方法

2.1 11C碘代甲烷生產(chǎn)及Triflate的在線轉(zhuǎn)換

在Sumitomo HM-20S回旋加速器上,用40μA 20 MeV質(zhì)子轟擊含1%氧的氮氣,利用14C(p,α)11C核反應(yīng),在靶內(nèi)生成11C-CO2。由單管、液相法自動化合成11C-碘代甲烷(11C-CH3I)。具體過程為:加速器生成的11C-CO2被液氮捕獲后,由氮氣以 40 m L/min速率載帶入0.2m L 1 mol/L氫化鋰鋁/THF溶液中反應(yīng),加熱除去THF后加入0.2m L 57%的氫碘酸,生成的11C-CH3I由40 m L/m in氮氣載帶通入Triflate-Ag轉(zhuǎn)化爐;11C-CH3 I在線轉(zhuǎn)化為11CH3-triflate[7]。

2.2 11C-CFN的合成

分別采用 LOOP法和反應(yīng)瓶法合成11CCFN。采用固相萃取法分析標(biāo)記率,HPLC方法分析放化純度。

2.2.1 LOOP法合成

分別采用游離酸型和鈉鹽型二種標(biāo)記前體合成11C-CFN。

采用游離酸型標(biāo)記前體:將1 m g游離酸型前體溶于0.2m L DMSO或DMF中,并加入等量的堿,將該溶液加入到HPLC的5m L的裝液環(huán)(LOOP環(huán))中,將2.1節(jié)合成的11CH3-triflate通過該環(huán),11CH 3-T riflate與環(huán)內(nèi)的液體膜接觸反應(yīng)生成11C-CFN。

采用鈉鹽型標(biāo)記前體:用0.2 m L DMSO或DMF溶解1 mg鈉鹽型前體后將其加入到HPLC的5 m L的裝液環(huán)(LOOP環(huán))中,將 2.1節(jié)生成的11CH 3-triflate通過該環(huán),11CH 3-triflate與環(huán)內(nèi)的液體膜接觸反應(yīng)生成11C-CFN。

2.2.2 反應(yīng)瓶法合成

采用游離酸型前體:用0.2 m L DMSO或DMF溶解1 mg游離酸型前體,并加入等量的堿后置于反應(yīng)瓶內(nèi),并將2.1節(jié)合成的11CH3-triflate通入反應(yīng)瓶,在反應(yīng)瓶內(nèi)合成11C-CFN。

采用鈉鹽型前體:在反應(yīng)瓶內(nèi)用0.2 m L DMSO或DMF溶解1 mg鈉鹽型前體,將2.1節(jié)合成的11CH3-triflate通入反應(yīng)瓶,在反應(yīng)瓶內(nèi)合成11C-CFN。

2.3 11C-CFN的全自動化合成裝置

合成碘代甲烷和膽堿模塊的示意圖示于圖1。該合成模塊與合成11C膽堿的模塊不同,主要在于以下三處:1)用合適的溶劑溶解前體后裝在反應(yīng)瓶中,取代了用C-18柱裝載前體;2)用Sep-Pak C2柱取代Sep-Pak CM柱;3)純化溶劑有區(qū)別,合成11C-CFN的淋洗液分別為10 m L 1%氨水、10m L水和1.0m L的無水乙醇。純化程序無區(qū)別,C2柱用5m L無水乙醇活化,再用10m L水沖洗即可。

圖1 膽堿模塊合成11C-CFN示意圖

2.4 11C-CFN質(zhì)量控制

用HPLC分析產(chǎn)品的放化純度,分析柱為G race A lltima C18(5 μm,10 mm ×250 mm),流動相為V(30%MeCN)∶V(水(含0.2%冰乙酸)),流速為1 m L/m in。用 LC/MS/MS測量產(chǎn)品的比活度[8]。

2.5 Micro PET/CT大鼠顯像

取SD大鼠,尾靜脈注射 0.2 m L的11CCFN樣品111 MBq。注射后25 min以2 m L/kg的劑量腹腔注射5%水合氯醛麻醉,置于eX-plore Vista Micro PET/CT上掃描腦部5 m in,先掃描PET再掃CT以定位,確定11C-CFN在大腦的濃集部位。

3 結(jié)果與討論

3.1 兩種標(biāo)記方法合成11C-CFN的比較

選擇兩種溶劑DMSO和DMF溶解鈉鹽前體,并裝載于LOOP環(huán)內(nèi),采用 DMSO為溶劑時,11C-CFN的合成效率為 5%,而采用DMF為溶劑的合成效率為10%。采用相同體積的DMSO溶解前體,反應(yīng)瓶法的合成效率約為80%。

目前很多11C藥物采用LOOP法合成[5,9],如11C-膽堿,直接將膽堿前體裝載于 LOOP環(huán)內(nèi),合成效率＞90%;2-(4'-N-11C-甲胺基苯)-6-羥基苯并噻唑(11C-PIB)也可以采用LOOP法,不校正合成效率約16%,而且是選擇性地在胺基上甲基化。LOOP法的原理主要針對小的反應(yīng)體積,將含前體溶液均勻涂布于四氟管的內(nèi)徑,以增加反應(yīng)面積,當(dāng)放射性氣體通過時與前體發(fā)生反應(yīng),降低了反應(yīng)溫度,提高了標(biāo)記效率。Studenov AR等[10]采用四丁基胺作催化劑,DMF作溶劑,用11C-CH3I為甲基化試劑合成11C-CFN,合成效率為64.1%,與本研究的結(jié)果相差很遠(yuǎn)。對比文獻(xiàn)與本研究的合成條件可知,文獻(xiàn)中主要以15 m L/min氦氣載帶碘代甲烷,將生成的約95%以上的放射性保留在LOOP環(huán)內(nèi),而本研究中載帶氣流為40m L/min,LOOP環(huán)僅能保留25%的放射性,其余均以氣體方式從LOOP環(huán)的另一端溢出;將載帶氣流流速降低到15 m L/min,合成效率提高不明顯,原因不詳,故以下研究及自動化合成均采用反應(yīng)瓶法。

3.2 二種CFN前體合成11C-CFN

采用 4-哌啶乙酸,4-[(1-丙羰基)苯胺]-1-(2-苯乙基)[游離酸]作前體,合成前加入等量的四丁基胺或NaOH或DMSO作溶劑,11C-CFN的合成效率為67.3%±2.3%(n=3)。以4-哌啶乙酸鈉,4-[(1-丙羰基)苯胺]-1-(2-苯乙基)[鈉鹽]作前體,合成效率為83.3%±3.1%(n=10),略高于以游離酸為前體的合成效率。這可能是由于以游離酸為前體時,加入的堿的量不能中和酸使反應(yīng)介質(zhì)呈酸性,因此以下合成采用鈉鹽前體。

3.3 不同溶劑中甲基化

采用鈉鹽前體,DMSO作溶劑,常溫下合成11C-CFN的合成效率為83.3%±3.1%(n=10)。采用相同前體,丙酮作溶劑,0℃下捕獲11CH3-triflate,捕獲完畢后升至室溫1 min,11CCFN的合成效率為72.3%±5.8%(n=3),略低于DMSO體系。

11C甲基化時,低溫下用丙酮作溶劑,丙酮捕獲11CH3-triflate或11CH 3 I的效率高于其他溶劑,同時在丙酮中甲基化效率高[11]。本研究采用丙酮的效率沒有明顯提高,可能是由于CFN的甲基化是羧基的甲酯化,不同于其他碳-氮或碳-氧甲基化。此外,丙酮甲基化時需將反應(yīng)瓶置于0℃,反應(yīng)完畢需升至常溫。因此本研究的自動化采用DMSO作溶劑。

3.4 11C-CFN的全自動化合成

根據(jù)以上優(yōu)化的條件,用0.2m L DMSO溶解0.5 mg去甲基CFN鈉鹽前體,裝載于尖底瓶中,并如圖1所示安裝于11C多功能模塊上,反應(yīng)瓶中插入11CH 3-triflate通氣管,另一端插排氣管(二管分別接在六通閥上);由模塊生成的碘代甲烷通過在線轉(zhuǎn)換生成11CH 3-triflate,11CH3-triflate經(jīng)二位六通閥 V 6通入尖底瓶中。11CH3-triflate傳輸完畢,啟動純化程序,計算機(jī)自動切換二位六通閥V 6,將原來的氣體通路變成液體通路,依次將1號瓶內(nèi)的10 m L 1%氨水壓入到尖底反應(yīng)瓶,稀釋反應(yīng)液,混合液流經(jīng)C-2柱分離,產(chǎn)品吸附在C-2柱上,用2號瓶內(nèi)10 m L水清洗C-2柱,最后用 3號瓶內(nèi)1.0 m L的無水乙醇將產(chǎn)品從C-2柱上洗脫到收集瓶,在收集瓶中加入9 m L生理鹽水。將收集瓶中的溶液過無菌濾膜后測量放化純度和比活度。

采用40μA 20 MeV的質(zhì)子轟擊氮氣靶30m in,最后能得到14.8～18.5 GBq的11CCFN。共合成了55次,校正的合成效率＞80%(依據(jù)11CH3-triflate計算)。從11CO2合成11CCH 3 I開始計時,到最后得到終產(chǎn)品,耗時18m in,其中合成11C-CH 3 I耗時12min,合成11C-CFN耗時6 min。

1%氨水清洗C-2柱的廢液的HPLC分析結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出,HPLC譜圖上僅有一個保留時間為2.5m in的峰,說明產(chǎn)品未從C-2柱上漏穿。

圖2 1%氨水清洗C-2柱的廢液的HPLC

3.5 11C-CFN的質(zhì)量控制

產(chǎn)品的HPLC分析結(jié)果示于圖3。分析圖3可知,產(chǎn)品11C-CFN的放化純度＞99%。圖3中,與放射性峰相對應(yīng)的紫外分析有一很小的吸收峰,其保留時間為7.36 m in,未見有其他化學(xué)雜質(zhì),放射性和紫外檢測器之間有一0.5 min死時間。由于載體CFN的量很少,為提高測量準(zhǔn)確性,采用 LC/MS/MS測量產(chǎn)品的比活度,結(jié)果顯示其比活度為1.4×1014Bq/g。

3.6 Micro PET/CT顯像

注射11C-CFN后25m in,Micro PET/CT大鼠頭部顯像示于圖4。由圖4可以看出,放射性主要分布于丘腦、紋狀體、大腦皮質(zhì)和嗅球等部位。這一分布特點與采用放射自顯影和原位雜交實驗得到的μ阿片受體及其m RNA的分布特點[12]一致。說明11C-CFN可以用于μ阿片受體的PET顯像研究。

圖3 11C-CFN的 HPLC分析

圖 4 大鼠注射11C-CFN后25～30m in的Micro PET/CT顯像

4 結(jié) 論

(1)利用商業(yè)11C膽堿模塊可以在18m in內(nèi)合成出總活度 14.8 GBq、比活度大于 1.4×1014Bq/g、放化純度大于95%的11C-CFN。

(2)Micro PET/CT顯像證實,11C-CFN可用于μ阿片受體的PET顯像研究。

[1]Bencherif B,Fuchs PN,Sheth R,et al.Pain activation of human sup raspinal opioid pathways as demonstated by[11C]carfentanil and positron em ission tomographpy(PET)[J].Pain,2002,99:589.

[2]朱國政,戴敦華.強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥卡芬太尼的合成[J].醫(yī)藥工業(yè),1988,19:9.

[3]Dannals RF,Ravert HT,Frost JJ,et al.Radiosynthesis o fan opiate recep tor binding radiotracer:[11C]carfentanil[J],Int JApp l Radiat Isot,1985,36:303.

[4]Jew ett DM.A sim p le synthesis of[11C]carfentanil using an ex traction disk instead o f HPLC[J].Nucl Med Bio l,2001,28:733.

[5]Shao X,K ilbourn MR.A simplemodification of GE tracerlab FX C Pro for rapid sequential preparation of11C-carfentanil and11C-raclopride[J].App l Radiat Isot,2009,67:602.

[6]張錦明,桂媛,徐志紅,等.阿片受體顯像劑:11CCarfentanil的前體合成及放射性標(biāo)記[J].核化學(xué)與放射化學(xué),2011,待發(fā)表.

[7]張錦明,田嘉禾,王武尚,等.在線制備11C-triflate-CH3[J].同位素,2006,19(2):124.

[8] Zhang XJ,Zhang JM.Quality control of11CCarfentanil[C]//Eighth China-Japan Joint Seminar on Radiopharmaceutical Chem istry.Beijing:Beijing Normal University,2010:73.

[9]Wilson AA,Garcia A,Chestakova A,et al.A rapid one-step radiosynthesis o f theβ-amy loid imaging radiotracer N-methy l-[11C]-2-(4'-methy lam ino-pheny l)-6-hydroxy benzothiazo le([11C]-6-OH-BTA-1)[J].J Labeled Com pd Radiopharm,2004,47:679.

[10]Studenov AR,Jivan S,Buck ley KR,et al.Ef ficient in-loop synthesis of high specific radioactivity[11C]carfentanil[J].J Lab Comp Radiopharm,2003,46:837.

[11]Zhang JM,Tian JH,Wang WS,et al.A new technique for labeling of[11C]-choline,a positronem itting tracer for tumor imaging[J].JRadio and Nucl Chem,2006,267:665-668.

[12]Mansour A,Fox CA,Akil H,et al.Opioid-receptormRNA expression in the ratCNS:anatom ica l and functional implications[J].Trends Neurosci,1995,18:22.